基于共振光散射技术的生物化学和分析化学检测方法研究

2015-06-23刘振林

西北民族大学学报（自然科学版） 2015年2期

关键词：共振染料探针

段辉，刘兰，刘振林，蔡兴

(甘肃省分析测试中心，甘肃兰州730000)

基于共振光散射技术的生物化学和分析化学检测方法研究

段辉，刘兰，刘振林，蔡兴*

(甘肃省分析测试中心，甘肃兰州730000)

文章综述了共振光散射探针的应用技术与原理，探讨了探针类化合物在蛋白质、核酸及痕量金属离子的检测方法及影响因素，为蛋白质和核酸分析方法的建立、螺旋结构及生物化学的研究提供思路，为提升金属离子检测限提供方法和依据.

光散射探针;蛋白质;核酸;金属离子;检出限

光散射技术在物理化学、胶体化学和高分子化学研究中具有十分重要的地位,但在生物化学和分析化学领域中尚未得到充分应用，且在传统的荧光测定中散射光常被做为一种干扰源被设法滤除.直到1993年才利用普通荧光分光光度计建立了通过共振光散射技术研究生物大分子的识别、组装和聚集的新方法[1].其机理是有机染料在蛋白质、核酸等生物大分子上进行堆积，导致烈的共振光散射增强，信号强度与生物大分子的浓度呈线性关系.共振光散射技术还可研究有机染料诱导蛋白质和核酸分子的构象变化以及核酸超螺旋结构的形成，并用于痕量金属离子的检测[2].本文针对光散射技术原理及其应用进行探讨.

1 有机染料分子聚集的共振光散射技术

在普通的荧光分光光度计上选择合适的激发和发射通带宽度，采用相等的激发和发射波长同时扫描单色器所得的同步光谱(即Δλ=0 nm)，即为散射粒子的共振光散射光谱.在仪器条件一定时，共振光散射强度与散射粒子的浓度成正比，据此可以用于散射粒子的定量测定.

利用共振光散射技术与吸收光谱法结合Pasternack研究14种卟啉化合物及二酸的堆集.由于静电引力和疏水作用[3]，阴离子卟啉常形成分子聚集体，从而提高平面振子的简并度. 实验发现四-(4-磺酸基苯基)卟啉(H2TPPS4)和三-(4-磺酸基苯基)卟啉(H2TPPS3)除了在434 nm处有峰外，在489 nm处也出现了小峰且H2TPPS4的强度小于H2TPPS3.尽管H2TPPS4在489 nm处的峰强度只有434 nm峰的1%，但却被共振光散射技术准确地检测到了.H2TPPS4和H2TPPS3在489 nm处出现的峰是由于电感偶合的卟啉聚集体而形成的[4、5].该峰只有在高酸度、高离子强度和卟啉浓度较大时才能得到，非离子卟啉H2THPP在水中以聚集态存在，在440～480 nm处存在强烈的共振光散射信号，有机溶剂可使H2THPP解聚，导致共振光散射信号降低.

在生物学上，叶绿体的聚集是叶绿体光化学和光物理行为的决定因素，与卟啉一样，叶绿体的聚集影响大环结构.研究表明，叶绿素在对应于469 nm处产生强烈的共振光散射增强信号，而在699 nm处产生与Qy带相对应的共振光散射峰.由此认为，叶绿体的聚集包括3个步骤：①二聚物的成核.②形成具有二级结构倾向的大聚体.③形成螺旋聚集体.

钴试剂(5-Cl_PADAB)在碱性条件下不稳定，随时间增加出现没有峰形变化的吸收光谱降低和共振光散射光谱的增强信号，但吸收峰位于458.4 nm,而最大共振光散射峰位于570 nm.虽然最大吸收与散射相距较远，但研究表明这种现象是由于钴试剂在碱性条件下发生了分子聚集[6].

2 在蛋白质测定中共振光散射探针的应用

表1 共振光散射测定蛋白质体系

有机小分子(如有机染料)与生物大分子物质如蛋白质、核酸作用时，结合数一般都较大，相当于有机小分子在生物大分子上进行堆积，因而能产生强烈的共振光散射增强信号.以有机染料作为蛋白质的光散射探针定量蛋白是基于蛋白质对有机染料的光散射信号的放大效应[7～8].光散射信号的增强与蛋白质的含量呈线性关系，从而可进行蛋白质分析.常用于蛋白质分析的光散射探针见表1所示.大多数探针属于三苯甲烷类，还有卟啉类、偶氮类等[9～12].溴酚蓝、铬天青S、铝试剂、四碘酚磺酞均属于非联苯型三苯甲烷试剂，而溴联苯三酚红、茜素紫和茜素菁绿属于联苯型染料.这些探针染料含有带电荷的亲水性集团，如磺酸基、羧基、酚羟基以及不带电荷的疏水性基团，如苯环及其他芳香性大环.蛋白质和染料探针之间以非共价键形式结合.在酸性条件下,带有相反电荷的染料与蛋白质以静电力相结合,同时非静电力(疏水力、范德华力、羟基力)与之协同作用.而蛋白质之所以对有机染料的光散射信号有放大效应，这与它们的反应模型有关.根据有关的光散射实验结果推测，由于蛋白质多肤链各部分的非极性侧链在疏水力作用下形成疏水核.其表面分布着许多带电荷的侧链，在酸性条件下带正电荷，因此，蛋白质上有许多结合位点.带负电荷的有机染料由于静电力被吸引至蛋白质表面，染料的非极性基团以疏水力和蛋白质的疏水核结合，在蛋白质的表面形成一个有机染料的覆盖层,这种以蛋白质为支撑核心的大染料聚合体体积远远大于染料自身聚集体的体积.由于粒子直径在5～100 nm时光散射信号与聚合体体积的二次方成正比，与单位体积内粒子数目即聚合体浓度也成正比，因此与蛋白质结合后的染料的光散射信号急剧增加,并与加入的蛋白质浓度成线性关系.因为光散射信号在溶质的吸收带附近可以被大大增强〈所谓的共振光散射),而且摩尔吸收系数越大，可能产生的光散射信号越强.所以，理想蛋白质的有机染料光散射探针应该有大的电子共轭环，有强的芳香性或疏水性并带有负电荷的亲水性基团，如磺酸基、羧基和酚羟基，水溶性或醇溶性好.这些探针中已经建立了以偶氮试剂对磺基苯偶氮变色酸作为光散射探针的微量蛋白质测定方法.

3 在核酸分析中共振光散射探针的应用

核酸是最早用光散射技术来研究和分析的生物大分子物质.早在1984年，knoll等就提出了以染料键合DNA引起染料的共振光散射增强进行DNA的光散射标记，但是并未引起足够的重视.直到1993年Pasternack才将光散射技术用于研究卟啉的J型堆积，即沿长轴包含线性振荡子极化的棒状组装.1995年，共振光散射技术作为一种研究色团聚集的新方法被正式提出.水溶性卟啉试剂TAPP是首先被用作核酸光散射分析的染料[13].它是一个带正电荷的大环共轭分子，与β型DNA作用不是嵌合式，而是卟啉取代基上的正电荷与核酸骨架上的磷酸根之间的静电作用[14].核酸对水溶性游离碱卟啉TMpyP-4、TAPP都有减色效应,但只对TAPP及质子化TAPP产生共振光散射增强.进一步研究发现，TAPP及质子化TAPP在核酸表面堆积，导致核酸超螺旋结构的形成，如果核酸是质子化的，将发生从核酸到卟啉TAPP的质子转移.在超螺旋结构中，堆积在核酸表面的卟啉分子结合产生了染料分子的高线性密度,导致了有效的电子激发离域，共振光散射增强就是由于这种核酸超螺旋结构中电子激发离域所引起的.利用核酸对TAPP的共振光散射增强可以测得纳克级的核酸，测定检测限比荧光淬灭法低一个数量级[15～19].

分光光度法研究表明,在碱性介质中钴(II)/钴试剂络合物与变性核酸作用,每个核苷酸残基上能结合2个二元络合物分子，形成了二元络合物分子在单链核酸上的堆积[5].利用共振光散射技术同样获得钴(II)/钴试剂配合物在核酸分子上的这种堆积，这种堆积导致核酸在547 m处使二元络合物的共振光散射信号剧烈增强，出现一个正好与三元复合物的吸收相对应的尖峰.利用此处共振光散射增强信号能测定纳克级的核酸，检测限低于1 μg/L，低于溴己锭荧光法.常用于核酸分析的光散射探针[20～25]见表2.

4 共振光散射探针在痕量金属离子测定中的应用

早在1995年研究发现罗丹明染料与离子缔合物产生共振发射光谱.在罗丹明染料的吸收波长和荧光发射波长之间出现强烈的共振光散射.碘负离子的存在使散射峰降低,而在更长波区形成新的共振光散射峰.如果进一步与金属离子形成缔合物，共振光散射峰还略有红移并增强.类似地,碱性三苯甲烷类染料如结晶紫、孔雀石绿、亮绿、碘绿等都有较弱的共振光散射信号,当其与碘负离子和金属离子形成离子缔合物时,将形成新的共振光散射光谱,据此可以测定纳克级的金属离子如Hg2+、Cr3+、Se4+、Mo5+等.如果逐点测定上述碱性三苯甲烷类染料在λem=(1/2)λem λem=2λem的散射光强度,可以获得较弱的二级散射(DS)和反二级散射(ADS).但当这些染料与碘负离子和金属离子作用形成离子缔合物时,将产生新的二级散射和反二级散射光谱,从而建立起基于离子缔合物的二级散射和反二级散射光谱的纳克级金属离子Hg2+和Se4+的分析测定方法[26～33].但二级散射和反二级散射的信号强度都比共振光散射信号弱,所建立的方法灵敏度相对低于基于共振光散射增强方法的灵敏度.离子缔合物的二级散射和反二级散射光谱变化是由于离子缔合物的形成使得静电引力、疏水作用导致分子间电荷转移以及反应前后分子大小差异所致.三氮烯试剂m-硝基苯偶氮-2-氨基噻唑与银离子在微碱性介质中形成1︰1配合物,显示强烈的共振增强的瑞利光散射,由此可以测定微克级银离子.共振光散射测定痕量金属离子见表3.

表2 共振光散射测定核酸体系

表3 共振光散射测定痕量金属离子

光散射探针目前可用于对气体(如大气微粒、烟、星际间尘埃等),液体,溶液(如胶体溶液、悬浮液、乳状液及各种天然和合成的高分子溶液等)、固体、晶体及液晶的研究.就所涉及的工业和科学领域来说,光散射探针已应用于石油化工、纺织纤维工业、橡胶、塑料工业、无机工业,以及材料科学、矿物学、生物学、医学、固体物理学、半导体物理学、地球物理学及宇宙空间等方面的研究，成为一种不可缺少的实验手段，它具有广阔的应用前景.尽管光散射理论己较为成熟,但共振光散射探针从1993年诞生至今,在其应用和研究中还有很多不足，因此要全面地理解和应用还需要大量的探索工作.

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