胰腺特异性表达Hes1基因的构建及体外表达

魏 静，杨希祥，石宁宁，宋小凤，冯 冲，潘登科*，臧荣鑫

(1.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730030；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京100193；3.南京农业大学动物科技学院，江苏南京210095)

胰腺特异性表达Hes1基因的构建及体外表达

魏 静1,2，杨希祥2,3，石宁宁2，宋小凤2，冯 冲2，潘登科1,2*，臧荣鑫1*

(1.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730030；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京100193；3.南京农业大学动物科技学院，江苏南京210095)

为了探究胰腺的发育机制，以及制备胰腺缺陷型的小型猪模型，构建了特异性表达载体，开展了相关载体构建及体外验证研究.本研究以小鼠PDX1启动子为特异性启动元件，构建胰腺特异性启动小鼠Hes1基因的表达载体PDX1-Hes1，载体转染MIN-6胰岛β细胞、猪耳成纤维细胞及猪肾细胞，培养48 h 后，通过qRT-PCR、Western Blot检测.结果显示：Hes1在MIN-6胰岛β细胞中的RNA水平和蛋白水平均高效表达，而在非胰腺细胞猪耳成纤维细胞及猪肾细胞中均不表达.试验表明：胰岛特异性表达载体PDX1-Hes1的成功获得，为构建相关基因在胰腺中特异性表达的载体提供参考，为后续制备胰腺缺陷型的小型猪提供了条件.

胰腺特异性表达；MIN-6胰岛β细胞；体外验证

近年来，糖尿病在我国发生的人数不断增多，患者数量居全球第一[1]，且具有年轻化的趋势，糖尿病成为严重危害人类健康的重要疾病之一.随着人们经济能力的提高和医院移植技术的不断完善，糖尿病患者对胰腺移植的需求与日俱增，胰腺移植供体却严重缺乏.器官移植是治疗人类器官衰竭，挽救人类生命的有效方法.由于器官移植供体来源缺乏，异种移植研究成为热门.在猪体内长出人源化器官成为器官异种移植供体来源之一，利用猪生产人源化胰腺，为解决糖尿病患者胰腺移植供体不足的问题提供了新思路.

PDX1(Pancreatic and duodenal home box factor-1)即胰腺十二指肠同源框蛋白1，它在胰腺生长发育过程中扮演重要角色.PDX1作为转录因子在胰腺中特异性表达，可以促进胰腺的早期发育和晚期胰岛细胞的分化，同时，PDX1在维持成体β细胞功能方面也起着重要的作用[2～3].这说明PDX1启动子具有特异性启动功能.Hes1(Hairy and enhancer of split homolog 1)是Notch信号通路系统的重要效应分子[4]，其基因编码的蛋白主要负责转录抑制，通过转录抑制影响胚胎发育期的细胞增殖和分化，并通过负反馈调控自我表达水平[5～6].最近研究发现，Hes1基因和胰腺发育有着密切的关系，在猪的胰腺形成时期，由PDX1启动子启动Hes1基因特异性过表达会生成胰腺缺陷猪[7].目前国内尚无类似报道.本试验成功构建了胰腺特异性表达载体PDX1-Hes1，建立了一条研究胰腺发育的特异性表达系统，为后续构建相关载体制备胰腺缺陷猪和研究胰腺发育提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小鼠胰岛素瘤β细胞株MIN-6细胞由解放军总医院内分泌实验室母义明教授惠赠；猪耳成纤维细胞由本实验室保存；PDX1-cre载体购自addgene；pEASY-T1 Simple Cloning Kit购自北京全式金生物技术有限公司；Premix TaqTM(LA TaqTMVersion 2.0 plus dye)酶购自宝生物工程(大连)有限公司；无内毒素质粒大量提取试剂盒购自凯杰企业管理(上海)有限公司；限制性内切酶主要购自New England Biolabs公司；抗体购自Santa Cruz公司和康为世纪生物技术有限公司；细胞培养相关耗材购自Corning公司和ScienCell公司；Sybr Select Master Mix购自Applied Biosystems公司；Western Blot实验材料购自碧云天生物技术公司和康为世纪生物科技有限公司；RNA及DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；其他化学试剂均购自Sigma-Aldrich公司.细胞转染依照NucleofectorⅡ转染仪及转染试剂进行转染.

1.2 引物设计

参考GenBank中小鼠Hes1基因序列(登录号：NC_000082)，设计引物为Hes1 F/R，片段大小为878 bp.参考GenBank中兔β-globin基因序列(登录号：NC_013669.1)，设计引物RB F/R从兔DNA中扩增出兔β-globin 3′调控元件(rabbit β-globin 3′flanking sequence，RB)，片段大小为1 125 bp；GAPDH为管家基因，引物为mGAPDH F/R产物长191 bp；表达检测引物qF1/R1，片段大小为176 bp；实时定量检测引物qF2/R2，片段大小为156 bp；设计引物的同时要加上相关酶切位点序列(详见表1及图1).PCR扩增反应体系(20 μL)：H2O 7 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板(50 ng/μL)2 μL，Premix TaqTM(LA TaqTMVersion 2.0 plus dye)10 μL.

表1 引物名称、序列、产物长度

1.3 PDX1-Hes1载体的构建

通过PCR技术从兔血DNA中扩增出RB，TA克隆后测序，获得T-RB克隆载体.将Hes1通过EcoRⅠ酶切位点插入到T-RB克隆载体中，克隆后经PCR鉴定为阳性的菌液送中美泰和公司测序，获得T-RB-Hes1重组质粒.PDX1-cre骨架载体和T-RB-Hes1重组质粒分别用XbaⅠ、NotⅠ两个酶进行双酶切，将PDX1启动子的骨架载体片段和RB-Hes1基因片段连接构成PDX1-RB-Hes1重组质粒，克隆后经PCR鉴定为阳性的菌液送中美泰和公司测序，最终成功构建了PDX1-Hes1载体(图1)，并经酶切验证正确后进行后续试验.

1.4 细胞培养、载体的转染

五指山小型猪耳成纤维细胞和猪肾细胞用高糖DMEM培养基(含15%胎牛血清，3.7 g/L碳酸氢钠、66mg/L青霉素、100mg/L链霉素、3.57 g/L HEPES)，在37 ℃，5%CO2中培养至细胞≥80%融合时消化，进行传代、冻存或实验.

小鼠胰岛素瘤β细胞株MIN-6细胞在37 ℃，5%CO2培养箱，高糖DMEM培养基中(需添加64 μmol/Lβ-巯基乙醇)培养至细胞≥80%融合时消化，进行传代、冻存或实验[8].

1.5 qRT-PCR和Western Blot

PDX1-Hes1载体使用无内毒素大提试剂盒提取后，转染准备.转染前24 h，以3×105细胞接种6孔板.转染步骤依照NucleofectorⅡ转染仪及转染试剂进行转染，每孔DNA用量为4 μg，以不转染载体的MIN-6胰岛β细胞组为阴性对照，培养48小时后收集细胞，分别提取细胞总RNA和细胞总蛋白.

图1 表达载体结构示意图和对应的酶切位点

qRT-PCR：转染48 h后的MIN-6胰岛β细胞、猪耳成纤维细胞和猪肾细胞，收集细胞提取RNA，定量1.5 μg反转为cDNA.根据Hes1 cDNA设计高度特异性引物qHes1 F2/R2检测转染后细胞中Hes1的mRNA 的表达.选取GAPDH为内参基因，取1.5 μL模板进行qRT-PCR检测.使用ABI 7500型定量PCR仪进行定量分析，每个待测样本设3个重复.采用相对定量方法进行定量分析.

Western Blot：用预冷的PBS洗脱转染48 h后的MIN-6胰岛β细胞、猪耳成纤维细胞和猪肾细胞，离心收集，使用RIPA裂解液分别提取两种细胞的总蛋白，95 ℃变性10 min.Bradford法定量，各取50 μg蛋白上样，5% SDS-PAGE上层胶和10% SDS-PAGE下层胶80 V电泳3 h，120 V转膜2 h，用PBST稍加漂洗，浸没于5%脱脂奶粉封闭液中缓慢摇荡2 h，PBST洗膜3次，每次10 min，HES1 Antibody (E-5)一抗(Santa Cruz；SC-166410)4 ℃过夜孵育，PBST洗膜3次，每次10 min，二抗室温孵育2 h，PBST洗膜3次，每次10 min，ECL发光仪成像.

图2 PDX1-Hes1酶切验证 图3 RT-PCR表达检测

注：1：EcoRⅠ酶切；2:XbaI和NotI双酶切； 注：A．耳成纤维细胞；B．肾细胞；C．MIN-6胰岛β细胞；1．qF1/R1；

M：DNA Maker(5 000 bp) 2．GAPDH-F/R；—：空白对照；M：DNA Maker 2000

2 结果

2.1 载体构建及酶切验证

载体PDX1-Hes1构建步骤见图1所示，用EcoRⅠ进行酶切得到Hes1片段，大小为866 bp.再用XbaⅠ、NotⅠ进行酶切得到RB-Hes1片段，大小为1 976 bp，酶切电泳结果见图2所示.结果表明，PDX1-Hes1载体构建成功.

图4 qRT-PCR表达检测 图5 Western blot分析Hes1的表达

注：—为阴性细胞; +为阳性细胞

2.2 RT-PCR与qRT-PCR

转染MIN-6胰岛β细胞、耳成纤维细胞和肾细胞的RT-PCR(引物：qF1/R1)检测结果显示，仅在MIN-6胰岛β细胞有表达，耳成纤维细胞和肾细胞均无表达(图3).说明本实验构建的载体能特异性地表达于胰岛β细胞.

qRT-PCR(引物：qF2/R2)检测结果显示，转PDX1-Hes1载体的阳性MIN-6胰岛β细胞RNA水平表达极显著高于未转染载体的阴性MIN-6胰岛β细胞(P<0.001)，内参基因为GAPDH，说明本实验构建的载体能高效表达于胰岛β细胞.

2.3 Western Blot

Western blot检测显示转PDX1-Hes1载体的MIN-6胰岛β细胞和阴性MIN-6胰岛β细胞在35 kDa处均有特异性条带，且与预期蛋白大小一致，证明两种载体在胰岛β细胞中均有表达.结果显示：在阳性MIN-6胰岛β细胞中表达量显著高于阴性细胞，证明本实验构建的载体在蛋白水平能高效表达胰岛β细胞.

3 讨论

目前，糖尿病已成为威胁全人类健康的重要疾病之一，是目前世界上最普遍和最具挑战性的重大公共卫生问题之一[9].异种胰岛移植的研究为根治糖尿病带来希望，但直接将猪的胰腺移植给糖尿病人会出现严重排斥反应，且异种胰腺会迅速坏死.为了解决超急性免疫排斥，国际上Lai等[10]采用敲除α-1 ,3-半乳糖转移酶基因的胎儿成纤维细胞作核供体，获得了α-1 ,3-半乳糖转移酶基因敲除猪.2011年，潘登科课题组在我国率先获得了敲除α-1 ,3-半乳糖转移酶基因的异种器官移植猪[11]，目前通过敲除α-1，3-半乳糖转移酶基因基本解决了异种移植时的超急性免疫排斥反应.在敲除Gal基因猪的基础上通过胚胎嵌合制备人源化胰腺成为克服异种移植免疫排斥的一种新思路.本试验成功地构建了胰腺高效表达Hes1基因的载体，因为Hes1基因和胰腺发育有着密切的关系，在猪的胰腺形成时期，通过表达Hes1基因会抑制胰腺的发育，从而制备胰腺缺陷猪[7].为了提高载体翻译效率，本实验前期制备了eGFP报告基因的模拟载体，通过优化比较证明在载体中添加kozak序列能够有效提高翻译效率[12].最终本研究选取了带有kozak序列的PDX1-Hes1载体，并进行了体外细胞验证，结果表明了载体在小鼠胰岛β细胞中特异性高效表达.

PDX1是胰腺发育、分化及维持体内葡萄糖代谢稳定的一种转录因子[13]，也是β细胞形成和成熟的标志之一[14].PDX1特异性表达于胰腺和十二指肠中，在PDX1基因敲除的小鼠中，未发现成熟的胰腺组织，十二指肠的一些区域也出现异常，在出生后很快死于高血糖症[15]，在缺乏功能性的PDX1蛋白的人群中，导致胰腺发育不全，但未造成缺失[16].由此可见，仅通过敲除PDX1基因获得的胰腺缺失动物存在问题，用之生产嵌合人源化胰腺的思路并不可行.有研究表明,在胚胎发育时期强迫Notch通路激活，诱使Hes1表达上升阻断胰腺内分泌细胞核外分泌细胞发育，并使胰腺外分泌细胞去分化，形成胰腺缺陷[17～18].通过PDX1启动子启动Hes1基因特异性表达，因此过表达Hes1来制备胰腺缺陷猪可以规避相关问题，且胰腺缺失后PDX1基因的存在对人源化胰腺的形成发育及胰腺功能维持有重要作用，有利于胰腺嵌合猪的正常生长.

本研究成功构建了PDX1-Hes1载体，为后续胰腺缺陷猪的制备打下基础，而Notch通路与胰腺发育有着密切关系.在本研究构建载体PDX1-Hes1的基础上构建相关载体，以胰腺缺陷动物模型为研究对象，来研究Notch通路.同时，也可以结合Notch信号通路构建相关基因表达载体来研究基因功能及胰腺发育机理.

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Construction and in Vitro Expression of Vectors Which Specifically Express Hes1 in Pancreas

WEI Jing1, 2,YANG Xi-xiang2, 3,SHI Ning-ning2,SONG Xiao-feng2,FENG Chong2,PAN Deng-ke1, 2，ZANG Rong-xin1

(1. Life Science and Engineering College of Northwest University for Nationalities，Lanzhou， 730030，China；2. Institute of Animal Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193，China；3. College of Animal Science and Technology，Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095，China)

The present study aimed to explore the development mechanism of pancreas, as well as the preparation of the pancreas miniature pig model of defect type, build the specific expression vector, conduct the related carrier construction and validation studies in vitro. PDX1 promoter of mice was token as a specific promoter element，the expression vector PDX1-Hes1 was constructed of pancreas-specific promoter Hes1 gene. This expression vector was transfected into MIN-6 pancreatic β cells, fibroblasts of pig ears and swine kidney cells. They were cultured for 48h and detected with qRT-PCR and Western Blot assay. The results showed that Hes1 RNA and protein levels were highly expressed in MIN-6 pancreatic β cells, but not fully expressed in fibroblasts of pig ears and swine kidney cells. The test demonstrated the PDX1-Hes1 of the islet specific expression vector was successfully obtained, which provided a reference for constructing the vector of carrier-related genes specifically expressing in the pancreas. It also built the conditions for preparing the miniature swine of pancreas deficient in the future.

Specific expression of pancreas；MIN-6 pancreatic β cell；In vitro validation

2015-05-20

国家重点基础研究发展计划(2015CB554103)；西北民族大学研究生科研创新项目资助(ycx14167).

*

魏静(1988—)，女，山西太原人，硕士研究生，主要从事基因与细胞工程研究.

Q78

A

1009-2102(2015)02-0016-05