功能化多壁碳纳米管修饰的葡萄糖传感器的研究

郭晓芸，郑亚男，杜霞，罗鸣，于文肖

(河北师范大学 汇华学院，河北 石家庄 050091)

功能化多壁碳纳米管修饰的葡萄糖传感器的研究

郭晓芸，郑亚男，杜霞，罗鸣，于文肖

(河北师范大学 汇华学院，河北 石家庄 050091)

在室温下利用化学掺杂法合成了K掺杂多壁碳纳米管KMWNTs,通过固定葡萄糖氧化酶(GOx)在KMWNTs修饰的玻碳电极表面，并利用葡萄糖氧化酶(GOx)的直接电化学，构建了一种新型葡萄糖传感器。利用扫描电镜对MWNTs和KMWNTs的形貌进行表征发现，K掺杂后没有破坏MWNTs的管状结构;采用电化学系统对传感器的性质进行了研究，结果表明，与单一的MWNTs相比，KMWNTs显示了更为有效的电催化活性。在此基础上,以KMWNTs膜为基底构建了抗干扰能力强、稳定性好、灵敏度高、响应快的葡萄糖传感器，在-0.52 V的检测电位下，该传感器对葡萄糖响应的线性范围为0.1～3.0 mmol·L-1(R=0.998)，检测限为0.02 mmol·L-1(S/N=3)，常见干扰物质如抗坏血酸和尿酸的存在不影响测定。

多壁碳纳米管；钾；葡萄糖氧化酶；电化学

酶传感器是生物传感器的重要组成部分。自从1962 年Clark[1]制成第一只酶传感器以来，酶传感器便迅速发展成为新的分析装置。它兼备酶法和电化学方法的优点，测定迅速而准确。特别是葡萄糖氧化酶传感器，由于它可为糖尿病患者的临床诊断提供非常重要的信息，因此它的研究已引起人们的高度重视[2]。但是这种方法的催化活性和稳定性不高，并且受温度、湿度以及pH值的变化影响较大。因此，寻找新材料、新方法制备电流响应值高的新型葡萄糖传感器非常必要。

碳纳米管(CNTs)构成了新的碳体系，其中化学掺杂在很大程度上修饰了它的物理性质，并加强了它的催化活性[3-5]。最近，各种元素如钾[4]、铯[6]、硼[7]、氮[8]、磷[9]和氯[10]等应用于CNTs表面掺杂以调整它们的场效应、电子、机械和导电性能，拓宽了CNTs的应用领域。Chun等[11]室温下制备了掺杂K的多壁碳纳米管，并证实了它们在乙醇中的分散性能。尽管科学家们已进行了各种各样的研究，但是仍然没有文献报道关于掺杂的CNTs在葡萄糖传感器方面的应用。

本文在室温下利用化学掺杂法合成的KMWNTs，展现了良好的膜稳定性、优越的生物兼容性和高的导电性。然后，以固定葡萄糖氧化酶(GOx)作模型酶，固定于KMWNTs修饰的玻碳电极(GCE)上，进一步研究了GOx的直接电化学，探索KMWNTs在葡萄糖传感器方面的应用。

1 实验部分

1.1 试剂和仪器

多壁碳纳米管(>95%，直径为20～30 nm)，深圳纳米科技有限公司生产；葡萄糖氧化酶(GOx)，美国Amresco公司生产；钾(K)、菲(98%)、二甲氧基乙院(99.5%,1,2-DME)、β-D-葡萄糖、抗坏血酸(AA)、尿酸(UA)均由美国Sigma-Aldrich公司生产；其它试剂均为分析纯。

扫描电镜图(SEM)来自于JEOL JSM-6700F场发射扫描电镜仪；循环伏安曲线(CV)在电化学工作站660C(上海辰华仪器设备公司，中国)上完成；电化学交流阻抗(EIS)测试在Autolab电化学分析仪(Eco Chemie，荷兰)上完成，其电解质溶液为含有5.0 mmol·L-1K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]的0.1 mol·L-1KCl溶液，交流电压为5 mV，记录频率为10-2～105Hz；本实验中所有的电化学测试均在0.1 mol·L-1的PBS中进行，室温为25±2 ℃，使用三电极系统，其中玻碳电极(GCE)为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极(SCE)为参比电极。

1.2 KMWNTs的合成

室温下利用化学掺杂方法合成KMWNTs，制备步骤如下[12]： MWNTs由体积比为3∶1的浓硫酸和浓硝酸处理4 h，离心，清洗至中性，60 ℃真空干燥；其后，在20 mL的1,2-DME(99.5%)溶液中，通过K(40 mg)和菲(0.2 mol·L-1)反应制备菲/K络合物溶液；然后，在上述络合物溶液中加入20 mg MWNTs，磁力搅拌(500 r·min-1)，室温下反应48 h，所得产物用乙醇清洗，沉淀物于60 ℃干燥得KMWNTs，再将其置于乙醇中超声分散得到0.5 mg·mL-1的KMWNTs悬浮液。

1.3 GOx/KMWNTs/GCE的制备

玻碳电极GCEs (d=3 mm, ca. 0.07 cm2)在SiC砂纸上打磨，在粒径为1.0 μm和0.3 μm的A12O3上抛光至镜面，分别在水和乙醇中超声2 min，室温下干燥。GOx/KMWNTs/GCE制备如下：先将5 μL 0.5 mg·mL-1的KMWNTs悬浮液滴涂于打磨好的电极上，室温下干燥，即得到KMWNTs修饰的GCE，记作KMWNTs/GCE;然后，将KMWNTs/GCE浸入含有10 U·mL-1GOx的 0.1 mol·L-1PBS (pH 7.4 )中，置于4 ℃冰箱10 h。

2 结果与讨论

2.1 MWNTs和KMWNTs形貌的表征

MWNTs和KMWNTs微观形态如图1所示。图1a中大量缠绕的MWNTs交错在一起，形成三维均一的结构。K掺杂后(图1b)，与MWNTs相比，KMWNTs的管束没有发现明显的破损和断裂，管束的直径有少许变大，整体结构变得松散;比表面积增大，吸附酶的能力增强。KMWNTs这种松散结构在电催化活性和蛋白质固定等方面起到了重要的作用。

图1 MWNTs(a)和KMWNTs(b)的SEM照片Fig.1 The SEM images of MWNTs(a)和KMWNTs(b)

2.2 交流阻抗图谱

电化学中常采用EIS阻抗谱的变化来表征电极表面的修饰过程，EIS的半圆直径代表电极表面电子转移阻抗(Ret) 的相对大小。图2显示了裸GCE， MWNTs/GCE和KMWNTs/GCE的交流阻抗波谱图。以[Fe(CN)6]3-/[Fe(CN)6]4-作为电化学活性探针，裸GCE和MWNTs/GCE的奈奎斯特图分别显示了约850 ohm和600 ohm的电子传递阻抗，比KMWNTs/GCE的电子传递阻抗(300 ohm)要大许多，表明KMWNTs能在氧化还原探针和电极之间形成一个优良的电子传递界面。

2.3 GOx/KMWNTs/GCE电极的直接电化学

基于在KMWNTs修饰电极上GOx的固定，我们在0.1 mol·L-1氮气饱和的 PBS (pH7.4)中研究了GOx的直接电化学(图3)。图3A中在没有GOx的存在下，各电极的循环伏安图上均无特征峰出现；图3B中GOx/KMWNTs/GCE出现了一对明显且峰形对称的氧化还原峰,其峰电流大于GOx、MWNTs/GCE,而GOx/GCE无任何氧化还原峰，其电位分别在-0.501 V和-0.478 V，显示了在无电子转移媒介体的情况下酶分子的氧化还原活性中心和电极之间良好的电子传递过程。

图2 裸GCE(a) ，MWCNT/GCE(b) ，KMWCNT/GCE(c)在5.0 mmol·L-1 K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]的0.1 mol·L-1 KCl底液中的交流阻抗图Fig.2 Electrochemical impedance spectra of bare(a),MWNTs(b) and KMWNTs(c) modified GCEs in 0.1 mol·L-1 KCl solution containing 5 mmol·L-1 K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]

与图3A的循环伏安图(无GOx)相比较，我们可以断定该氧化还原峰应归属于GOx。结果表明：KMWNTs比MWNTs更有利于GOx的直接电化学。

2.4 GOx/KMWNTs/GCE的线性关系和检出限

图4A显示了GOx/KMWNTs/GCE在氮气饱和的PBS中响应电流随葡萄糖浓度变化的差分脉冲伏安曲线。如图4A可知，在0.1 mol·L-1氮气饱和的PBS(pH7.4)中，葡萄糖的浓度从0，0.1，0.2，0.6，1.0，1.4，1.8，2.2，2.6，3.0 mmol·L-1依次变化时，随着葡萄糖浓度的增加，还原峰电流逐渐降低。而且，还原峰电流的降低量与葡萄糖浓度之间存在良好的线性关系(图4B)，相关系数R=0.998，传感器的线性范围为0.1～3.0 mmol·L-1，检出限(S/N=3)为0.02 mmol·L-1，该传感器对葡萄糖的检测灵敏度较高[13]。

2.5 GOx/KMWNTs/GCE抗干扰能力测试

为了评价传感器的抗干扰能力，向含有0.5 mmol·L-1的葡萄糖溶液中分别加入浓度为0.05 mmol·L-1尿酸(UA)以及抗坏血酸(AA)进行实验，如图5所示，结果表明加入的AA与UA对葡萄糖的测定无明显的干扰。对这2种干扰物质具有良好的抗干扰能力，说明该传感器具有较好的选择性。为了评价传感器的重现性，分别制备5根GOx/KMWNTs/GCE测定5 mmol·L-1葡萄糖溶液，其相对标准偏差(RSD)分别是4.1%，4.4%，4.7%和5.1%。此外，用同一根GOx/KMWNTs/GCE 5次测定5 mmol ·L-1葡萄糖溶液，其RSD是1.9%。当传感器不用时，4 ℃保存，定期测试，结果如图6所示，第8天其响应电流约为最初响应的97%；一个月以后，其响应电流约为最初响应的77%。表明该传感器具有较好的稳定性。

图3 在0.1 mol·L-1 氮气饱和的PBS(pH7.4)溶液中(A)裸GCE(a), MWNTs/GCE(b), KMWNTs/GCE (c)；(B)GOx /GCE(a),GOx/MWNTs/GCE (b),GOx/KMWNTs/GCE (c)的循环伏安曲线 扫速：30 mV s-1Fig.3 Cyclic voltammograms of different electrodes in 0.1 molL-1 nitrogen-saturated PBS (pH 7.4). (A) Bare GCE (a),MWNTs/GCE (b),KMWNTs/GCE (c); (B)GOx /GCE(a),GOx/MWNTs/GCE (b),GOx/KMWNTs/GCE (c); Scan rate: 30 mV s-1

图4 (A)GOx/KMWNTs/GCE在氮气饱和的0.1 mol·L-1PBS(pH7.4)中响应电流随葡萄糖浓度变化的差分脉冲伏安曲线；(B)峰电流与葡萄糖浓度关系曲线Fig.4 (A)Differential pulse voltmmograms of the GOx/KMWNTs/GCE in nitroger-saturated 0.1 mol·L-1 pH 7.4 PBS with different glucose concentrations:0.0,0.1,0.2,0.6,1.0,1.4,1.8,2.2,2.6,3.0 mmol·L-1;(B)Calibration curves of the GOx/KMWNTs/GCE for glucose

图5 抗干扰物质存在下GOx/KMWNTs/GCE的相应电流Fig.5 Amperometric responses of the GOx/KMWNTs/GCE in the absence and presence of interferent

图6 时间对GOx/KMWNTs/GCE稳定性的影响Fig.6 Effect of duration on the response of the biosensor to 5 mmol·L-1 glucose in 0.1 mol L-1 PBS (pH 7.4)

3 小结

通过固定GOx在KMWNTs修饰的玻碳电极表面，并利用GOx的直接电化学，构建了一种新型的葡萄糖传感器。实验结果发现K掺杂后不仅没有破坏MWNTs的管状结构，而且还有良好的膜稳定性、优越的生物兼容性和高的导电性，可以用来增强电化学响应，并提供显著增加的有效面积以利于蛋白质的负载，加速了酶活性区和电极表面之间的电子传递。采用电化学系统对传感器的性质进行了研究，GOx/KMWNTs/GCE展示了良好的重现性和稳定性，以及高的灵敏性和无干扰性，因此，KMWNTs能作为一种优异的材料用于氧化还原活性酶的直接电化学，并构建相关的酶生物传感器。

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(责任编辑：孙新华)

Glucose Sensor Based on Potassium-doped Multi-walled Carbon Nanotubes

GUO Xiaoyun, ZHENG Yanan, DU Xia, LUO Ming，YU Wenxiao

(Huihua College of Hebei Normal University, Shijiazhuang Hebei 050091, China)

The potassium-doped multi-walled carbon nanotubes (KMWNTs) were synthesized according to the chemical K doping at room temperature. We demonstrate herein a newly developed amperometric glucose biosensor by using the direct electron transfer of glucose oxidase (GOx), which is base on the immobilization of GOx on KMWNTs modified electrodes. The structures of the MWNTs and KMWNTs were characterized by scanning electron microscopy( SEM). After K-doping, no disruption of MWNTs morphology is observed . As a new platform in glucose analysis, the resulting electrode (GOx/KMWNTs/GCE) exhibits a sensitive response to glucose, with a linear range from 0.1 to 3.0 mmol·L-1(R=0.998) and a detection limit of 0.02 mmol·L-1(S/N=3). At an applied potential of -0.52 V, the resulting biosensor performs a sensitive and selective electrochemical response to glucose in the presence of common interferences, such as ascorbic acid (AA) and uric acid (UA). These results indicated that the GOx/KMWNTs modified glassy carbon electrode presents stable, high sensitivity and also exhibits fast amperometric response to the detection of glucose, which is promising for the development of glucose sensor.

multi-walled carbon nanotubes; potassium; glucose oxidase; electrochemistry

10.16018/j.cnki.cn32-1650/n.201504012

2015-08-31

郭晓芸(1981-)，女，河北石家庄人，讲师，硕士，主要研究方向为生物传感器。

O657.1

A

1671-5322(2015)04-0051-05