分散液-液微萃取-气相色谱-质谱法同时测定中毒样品中有毒生物碱和鼠药

麦沛明 余胜兵 吴西梅 苏广宁 钟秀华 朱炳辉

1(中山大学公共卫生学院，广东510080)

2(广东省疾病预防控制中心，广东511430)

1 引言

生物碱和鼠药均可引起急性中毒，危及人体安全。我国民间常使用中草药浸泡药酒，甚至以此“进补”，容易因误食、过量使用而引发急性中毒;不法分子利用含有毒生物碱的中草药用于谋杀而引起的中毒事故屡有发生［1～3］。另外，由于鼠药导致的食物中毒事件频繁发生。部分鼠药和生物碱中毒的临床症状相似，如毒鼠强与东莨菪碱中毒初期症状均有视力模糊、心跳紊乱等症状。当疑似有毒生物碱或鼠药中毒事件发生时，医生仅根据患者的临床表现进行诊断，可能存在误诊的风险。实验室检验能在短时间内检测出致毒物质，让中毒患者得到及时的对症抢救，还可为公安机关侦破案件提供技术支持。因此，建立快速、准确的生物碱和鼠药同时筛查的方法具有较好的实用意义［4～7］。

目前，对有毒生物碱和鼠药的研究多针对单一生物碱或鼠药。有毒生物碱和鼠药的常用分析方法包括薄层色谱法(TLC)［8］、液相色谱法(LC)［9］、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)［10］、液相色谱-质谱联用法(LC-MS/LC-MS/MS)［4，11，12］、毛细管电泳-电喷雾飞行时间质谱(CE-ESI-TOF-MS)［13］等。TLC 和LC无法对目标物进行结构定性，而LC-MS/LC-MS/MS 和CE-ESI-TOF-MS 价格昂贵，较难在一般实验室普及。GC-MS 具有价格适中、分析速度快、可对目标化合物进行准确定性的优点，在一般实验室中普及率较高。尚未见对上述5 种生物碱和3 种鼠药采用GC-MS 同时检测的报道。另外，中毒样品的前处理多采用液-液萃取［14，15］、固相萃取［16］等方法，这些前处理方法需求样品量较大、操作繁琐，耗时，消耗试剂较多，不能很好地适应中毒应急检测的需要。分散液-液微萃取技术(DLLME)是由Rezaee 等［17］于2006 年提出的一种环保、高效、简便、成本低、富集倍数高的样品富集技术。目前，DLLME 已被广泛应用于不同基质样品痕量分析［18～22］。本研究对DLLME 过程中的各种影响条件进行优化，采用GC-MS 检测方法，成功将其应用于水、尿液、黄酒及米饭等模拟毒样品中鼠药和生物碱的同时测定。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Trace GC Ultra-ISQ 气相色谱-质谱联用仪(美国Thermo Fisher 公司);HS20500D 离心机(中国恒奥公司);漩涡振荡器(美国SI 公司);Milli Q Biocel A10 超纯水系统(法国Millipore 公司);生物碱及鼠药标准:莨菪碱、东莨菪碱(98.87%，TRC 公司);马钱子碱(98.87%)、士的宁(99.5%)，Chem Service公司);钩吻素甲(98.87%)、毒鼠强(99.5%)、溴鼠灵(98.87%)、溴敌隆(99.5%)均由北京世纪奥科生物技术有限公司提供;甲醇、乙腈、丙酮、四氢呋喃、氯仿、四氯化碳、氯苯、二硫化碳(分析纯，广州化学试剂厂);混合标准储备液中各目标物浓度见表1。

空白水样为自来水;空白尿样由志愿者提供;空白酒样为客家黄老酒(广东省河源市紫金县紫金实业发展有限公司);空白饭样为熟米饭。

2.2 疑似中毒模拟样品制备与处理

2.2.1 样品制备 分别取空白水样、尿样、酒样1 mL，米饭样1 g 于15 mL 离心管中，加入适量目标物混合标准溶液，振荡摇匀，得到模拟中毒样品。

2.2.2 样品处理 经2.2.1 节处理后的样品，加入10 mL 5%(w/V)NaCl 溶液，经NaOH 溶液调节至pH 8。米饭样品先经离心，取上层清液5 mL 再进行后续步骤。将100 μL 氯仿和600 μL 甲醇的混合液快速注入样品中，获得浑浊、雾化乳浊液。10 s 后8000 r/min 离心5min，取下层有机相进行测定。

2.3 色谱与质谱条件

色谱条件:色谱柱:DB-5MS UI 毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，进样口温度:280 ℃;柱温升温程序:初始温度80 ℃，保持1 min，以20 ℃/min 升温到280 ℃，保持23 min，再以40 ℃/min 升温到300 ℃，保留1 min;质谱条件:离子源温度:280 ℃;传输线温度:280 ℃;EI 电压:70 eV;选择离子模式测定，各种待测物选择离子见表1。

表1 目标物的保留时间、定性离子和定量离子及混标中的浓度Table 1 Retention time，qualitative ion，quantitative ion，concentrations of target analytes in standard stock solution

3 结果与讨论

3.1 样品前处理条件的优化

3.1.1 萃取剂种类与体积的选择 传统的分散液-液微萃取常采用密度高于水且在水中溶解度小、对目标成分具有良好萃取能力、色谱出峰不影响目标物的有机溶剂作为萃取剂。本实验分别考察了氯苯、二硫化碳、氯仿和四氯化碳4 种有机溶剂作为萃取剂时目标物的回收率。图1A 表明，氯仿对8 种目标物均具有较好的萃取效率。因此，选氯仿作为萃取剂。考察氯仿体积在40 ～120 μL 时各目标物的回收率，如图1B 所示，大多数目标物在100 μL 时达到最佳萃取效果，因此，选择氯仿的优化体积为100 μL。

3.1.2 分散剂种类与体积的选择 分散液-液微萃取要求分散剂与萃取剂和水均可混溶，两者混合加入，使萃取剂以微小液滴高度分散于水相中，增大两相接触的比表面积，有效缩短萃取时间，同时提高萃取效率。本实验分别考察了丙酮、乙腈、甲醇、四氢呋喃作为分散剂时目标物的回收率。结果表明，甲醇对大多数目标物有较好萃取效率，选取甲醇作为分散剂并考察其在400 ～1500 μL 范围内对回收率的影响，发现甲醇的体积为600 μL 时目标物回收率较高。因此，选择甲醇的优化体积为600 μL。

图1 萃取剂种类(A)及其体积(B)对目标物萃取效率的影响Fig.1 Effect of (A)extraction solvent and (B)extractant volume on the extraction efficiency of analytes Conditions:sample volume，5 mL;extraction volume，100 μL;dispersive agent type，methanol;dispersive agent volume，600 μL;pH，8;salt concentration，5%(w/V).1.Tetramine;2.Bromadiolone;3.Hyoscyamine;4.Scopolamine;5.Gelsemine;6.Brodifacoum;7.Strychnine;8.Brucine.

3.1.3 pH 值及盐浓度的影响 考察了pH 2 ～14 范围内目标物的回收率。结果表明，大多数目标物在pH=8 时有较高回收率。一般情况下，水相离子强度增加会降低目标物在水中的溶解度，从而提高萃取效率。实验考察了NaCl 浓度在0 ～15%(w/V)范围内对目标物回收率的影响，结果表明不同浓度NaCl 对生物碱的萃取效率影响较大，对鼠药的萃取效率影响不明显。这可能是由于鼠药在氯仿中溶解度较大，在萃取过程中鼠药受水相盐浓度的影响较小。因此，选择pH =8，NaCl 浓度为5%(w/V)的条件对目标物进行萃取。

3.2 方法学考察

3.2.1 方法的线性关系与检出限、定量限 取空白液态样品1 mL，米饭样品1 g，将储备液(浓度见表1)用甲醇稀释1，2，5，10，20 倍后加入样品中，每一浓度5 份，再按2.2 节对样品进行提取，在优化的色谱-质谱条件下，对目标物进行分析。考察了方法的线性范围、检出限(LOD，S/N =3)和定量限(LOQ，S/N=10)，结果见表2。表明本方法灵敏度远低于各目标物的中毒剂量，可用于疑似鼠药或生物碱中毒症状的快速筛查。

表2 DLLME-GC-MS测定模拟中毒样品中目标物的线性关系、检出限、定量限Table 2 Linear relationships，LOD and LOQ for analytes in simulated toxic samples determined by dispersive liquid-liquid microextraction-GC-MS (DLLME-GC-MS)

3.2.2 方法的回收率与精密度 取空白样品，准确加入适量的混合标准溶液，按照2.2 节进行提取，在相同的色谱-质谱条件下平行测定3 次，计算回收率和精密度(表3)。结果表明，目标化合物在不同基质中加标回收率为81.0% ～110%。图2 为标准溶液、尿液、黄酒、米饭加标后的典型色谱图。研究结果表明，本方法可快速测定食物中毒样品中3 种鼠药(毒鼠强、溴鼠灵、溴敌隆)和5 种有毒生物碱(莨菪碱、东莨菪碱碱、钩吻碱、士的宁、马钱子碱)。与传统萃取方法相比，DLLME 具有所需样品量少，萃取时间短，操作简单、快速的特点，适用于中毒事件和法医毒物分析中鼠药和生物碱中毒的快速分析。

图2 目标物的色谱图Fig.2 Chromatograms of standard solution of target analytes

表3 模拟中毒样品中目标物的加标回收实验结果(n=3)Table 3 Result of recovery test for the target analytes in simulated toxic samples (n=3)

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