微电场刺激血管内皮细胞培养上清对缺氧培养滋养细胞迁移/侵袭的影响

张 娟，白 怀，范 平

(1.四川省医学科学院·四川省人民医院检验科，四川 成都 610072；2.四川大学华西第二医院西部妇幼医学研究院，四川 成都 610041)

微电场刺激血管内皮细胞培养上清对缺氧培养滋养细胞迁移/侵袭的影响

张 娟1，白 怀2，范 平2

(1.四川省医学科学院·四川省人民医院检验科，四川 成都 610072；2.四川大学华西第二医院西部妇幼医学研究院，四川 成都 610041)

目的 探讨微电场(electric field，EF)刺激血管内皮细胞培养上清对缺氧培养滋养细胞迁移/侵袭能力的影响。方法 200 mV/mm微电场刺激血管内皮细胞(HUVEC)5 h，收集培养上清。Transwell 体外侵袭实验和划痕实验观察EF刺激内皮细胞条件培养基对3% O2物理缺氧培养滋养细胞迁移/侵袭功能的影响。采用Western blot和荧光定量RT-PCR检测 EF刺激的血管内皮细胞条件培养基与滋养细胞共培养24 h后对缺氧培养滋养细胞MMP-2(Matrix metalloproteinase 2，MMP-2)及MMP-9(Matrix metalloproteinase 9，MMP-9)分子表达的影响。结果 Transwell小室体外侵袭实验和划痕实验结果显示，EF 200 mV/mm 刺激血管内皮细胞5 h条件培养基(conditioned medium，CM)与滋养细胞共培养，可促进缺氧培养滋养细胞迁移/侵袭功能，其穿膜细胞数目是单纯缺氧的3.62倍(P< 0.05)，迁移速度是单纯缺氧的1.56倍(P< 0.05)。EF刺激的血管内皮细胞条件培养基与滋养细胞共培养24 h，可以促进缺氧培养滋养细胞的MMP-2表达；对MMP-9分子表达的影响不明显。结论 EF刺激的血管内皮细胞培养上清能促进缺氧培养滋养细胞的迁移/侵袭能力，可能与内皮细胞作用于滋养细胞、促进MMP-2分子表达增加有关。

直流微电场；缺氧；滋养细胞；内皮细胞；细胞迁移/侵袭

在生理状态下，妊娠胚胎植入早期绒毛外滋养细胞(extravillous trophoblasts，EVT)侵入蜕膜组织和子宫螺旋动脉，并使后者发生改建变成低阻、高容量血管，维持足够的母体血液流入绒毛间支持胎盘的功能。滋养细胞适度地侵入子宫内膜是维持妊娠和胎儿发育的前提条件。EVT侵入不足所致的胎盘缺血缺氧，可导致异常产科结局如流产、子痫前期和胎儿宫内生长受限等。Onogi等研究显示[1]，低氧可抑制妊娠胎盘组织来源的EVT的侵袭功能，并与下调MMP-2分子活性有关。母胎界面滋养细胞功能受到微环境因素的影响，包括血管内皮等因素的作用。我们近年的研究发现[2]，微电场(electric field，EF)可以促进血管内皮细胞分泌血管生成活性因子血管内皮生长因子(VEGF)、白细胞介素-8(IL-8)，且这些因子能促进包括滋养细胞在内的多种细胞的迁移等活性[3]。鉴于缺氧环境对滋养细胞的运动活性具有显著的影响，探讨促进这些细胞迁移/侵袭功能具有实际意义。因此，本课题拟观察EF刺激的血管内皮细胞培养上清是否对缺氧环境的滋养细胞迁移/侵袭功能具有促进作用。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂 绒毛外滋养细胞HTR-8/SVneo(加拿大Queens University提供)，人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)(英国Aberdeen大学Prof.Min Zhao提供)。医用高纯氮气(N2)及医用CO2(四川大学华西第二医院提供)。Transwell小室(购自Millipore)，细胞培养板(购自Costar)，RPMI-1640培养基、DMEM培养基、胎牛血清、0.25%胰酶等(购自GIBCO公司)。Matrigel(购自BD公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 内皮细胞的培养及加电 内皮细胞以DMEM在5%CO2、37 ℃细胞培养箱中培养，培养基含有20%的小牛血清、0.04 mmol/L 的谷氨酰胺、青霉素104 U/L、链霉素100 mg/L。每次实验前24 h将冻存的细胞复苏后以5 ×103个细胞/cm 的密度接种于预制的细胞培养槽中，该培养槽由两片24 mm ×22 mm、平行放置、相距10 mm的盖玻片通过硅酮胶(Dow Corning)固定于100 mm ×20 mm 的组织培养皿的底面而形成一个两端开放的细胞培养小室。对培养小室内细胞电场刺激5 h后，收集培养上清。

1.2.2 Transwell体外侵袭实验 用无血清1640以1∶3 比例稀释Matrigel(10 mg/L)后包被基底膜，放入37 ℃培养箱孵育至少半小时。取生长融合至80%的HTR-8/SVneo细胞，加入不含胎牛血清的1640培养基，37 ℃、5%CO2静置培养12 h，消化细胞后用无血清培养基重悬，调整细胞密度至(7～8)×105/ml，无菌条件下取出Millicell-插入小室，放进无菌24孔培养板中。在24孔板中分别加入600 μl 预热的HUVEC加电和对照组的上清。取细胞悬液300 μl，加入包被好的Transwell上室。将加好细胞悬液的培养板分别放入正常培养状态(5%CO2，95% O2)和缺氧状态(5%CO2，3% O2，92% N2)培养细胞，均培养90 h。然后取出插入小室，用棉签轻轻拭去上室滤膜内面的基质胶和细胞，将整个插入小室放进24孔板中，95%酒精固定15 min，0.1%结晶紫染色20 min，计数穿过膜的细胞数，整个实验重复3次。

1.2.3 划痕实验 用记号笔在6孔板背后用直尺比着，均匀划横线。在孔中加入约5×105个细胞，过夜培养。第二天用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，用预热的PBS清洗细胞3次，去除划下的细胞，然后分别加入无血清培养基作为对照组和条件培养基作为实验组，放入培养箱缺氧状态(5%CO2，3% O2，92% N2)分别培养24 h和30 h，拍照记录。

1.2.4 Western-blot及 RT-PCR Western-blot检测采用常规方法，收集细胞，用RIPA裂解细胞提取总蛋白质，确定点样量，经SDS-PAGE凝胶电泳，蛋白转移至硝酸纤维素膜。分别与MMP2、MMP9、GAPDH蛋白抗体及二抗反应后化学发光显色，阳性条带以凝胶吸光度分析软件测定积分吸光度值为其蛋白量。RT-PCR按常规方法提取RNA再逆转录。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0统计学软件进行数据处理。计量资料以均数±标准差表示，采用t检验和方差分析。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EF刺激HUVEC的条件培养基促进缺氧培养滋养细胞的迁移功能 划痕实验结果显示，对照组细胞和实验组细胞均在缺氧条件下培养，培养24小时后，实验组细胞向划痕处迁移生长的细胞数目明显多于对照组，30小时后几乎布满划痕位置，迁移速度是单纯缺氧条件迁移速度的1.56倍。见图1。

图1 EF刺激的血管内皮细胞培养上清促进缺氧滋养细胞的迁移(Bar=100 μm)

2.2 EF刺激HUVEC的条件培养基促进缺氧培养滋养细胞的侵袭功能 Transwell小室侵袭实验结果显示，EF(200mV/mm)刺激血管内皮细胞5 h条件培养基与滋养细胞共培养，可以促进缺氧培养条件滋养细胞的穿膜(侵袭)功能(穿膜细胞数是单纯缺氧条件穿膜细胞数的3.62倍)，而单纯缺氧条件滋养细胞的穿膜数目较正常氧环境培养细胞显著降低，见图2。

图2 EF刺激的血管内皮细胞培养上清促进滋养细胞的侵袭力(Transwell实验，Bar=100 μm)

2.3 微电场刺激HUVEC的条件培养基对缺氧培养滋养细胞迁移/侵袭相关分子MMP-2和MMP-9表达的影响 Western blot结果显示，上述EF刺激的血管内皮细胞条件培养基与滋养细胞共培养24 h，可以促进缺氧培养条件(3% O2)滋养细胞的MMP-2的表达，而单纯缺氧培养滋养细胞MMP-2表达较正常氧环境培养细胞的表达显著降低，但对MMP-9分子表达的影响不明显。荧光定量PCR法对mRNA水平的分析结果与上述蛋白水平的结果一致，见图3、图4。

图3 EF刺激血管内皮细胞培养上清促进滋养细胞MMP-2的表达

图4 EF刺激血管内皮细胞培养上清对MMP-9表达的影响

3 讨论

孕早期EF适度地侵入子宫内膜，在母胎循环的建立及成功妊娠方面发挥关键作用。EVT侵入不足可能导致流产、子痫前期和胎儿宫内生长受限等产科不良结局。在生理状态下，妊娠早期(前三个月)胎盘和胚胎均处于低O2分压的环境。研究发现在孕11周之前胎盘氧分压低于蜕膜氧分压[4，5]。大约孕12周胎盘氧分压才与蜕膜氧分压相同[4，5]，胎盘氧分压与孕周之间存在正相关关系。因此，缺氧可能在正常和病理性妊娠过程中胎盘形成及其功能调节方面起重要作用。

缺氧环境对滋养细胞侵袭/迁移的影响存在广泛的争论。一些研究结果显示，缺氧对滋养细胞侵袭功能产生促进作用，例如，Lash 等研究发现，与20%氧环境结果比较，缺氧(1%O2)培养的HTR-8/SVneo 24 h，促进细胞的侵袭能力[6]，而Kilburn等的研究发现，滋养细胞HTR-8/ SVneo在缺氧(2% O2)培养72 h，其侵袭能力降低[7]；另一项类似研究显示，JEG-3和HTR-8/SVneo在缺氧(2% O2)培养24 h，其侵袭活性增强，但培养72 h其侵袭能力降低。本研究发现，3% O2环境中滋养细胞HTR-8/SVneo培养90 h其侵袭能力受到抑制，与Kilburn等[7]的结果一致。关于这些研究结果不一致的原因，可能与细胞种类、培养方法如缺氧时间及程度的不同等有关。

滋养细胞的生物学行为受局部环境众多因素的影响，包括血管内皮细胞等因素的作用。我们前期研究发现EF可以促进血管内皮细胞分泌血管生成活性因子VEGF和IL-8[3]，这些因子是促进细胞迁移的重要活性分子。我们推测，这些活性分子对滋养细胞功能、特别是缺氧环境中滋养细胞侵袭/迁移功能可能具有影响。本研究结果显示，EF刺激血管内皮细胞5 h的条件培养基与缺氧环境滋养细胞共培养90 h，可明显促进其穿膜的能力：与对照培养细胞相比，穿膜细胞计数是单纯缺氧培养的3.62倍，迁移速度是单纯缺氧培养的1.56倍，提示血管内皮细胞来源的旁分泌因子可能对缺氧滋养细胞的侵袭功能起促进作用。

本研究还发现，3% O2的缺氧环境培养滋养细胞MMP-2的表达降低，与Onogi等[1]的研究结果一致，但对MMP-9的表达影响不明显，与张雅琪等[8～10]的报道不一致，可能与缺氧条件、缺氧时间及滋养细胞种类不同有关。本研究显示，EF刺激血管内皮细胞的条件培养基促进滋养细胞的侵袭功能可能与其上调MMP-2的表达有关。

上述结果提示，EF刺激的血管内皮细胞培养上清能促进缺氧滋养细胞的迁移/侵袭能力，可能与内皮细胞分泌的相关活性分子如VEGF和 IL-8等作用于滋养细胞、促进MMP-2分子表达增加有关。

[1] Onogi A，Naruse K，Sado T，et al.Kobayashi.Hypoxia inhibits invasion of extravillous trophoblast cells through reduction of matrix metalloproteinase(MMP)-2 activation in the early first trimester of human Pregnancy[J].Placenta，2011，32：665-670.

[2] Juan Z，Rongmei R，Xuefeng L，et al.A small physiological electric field mediated responses of extravillous trophoblasts derived from HTR8/SVneo cells：Involvement of Activation of Focal Adhesion Kinase Signaling[J].PLOS ONE，2014，3(9)：e92252.

[3] Bai H，Forrester JV，Zhao M.DC electric stimulation upregulates angiogenicfactors in endothelial cells through activation of VEGF receptors[J].Cytokine，2011，55(1)：110-115.

[4] Jiang R，Cai J，Zhu Z，et al.Hypoxic trophoblast HMGB1 induces endothelial cell hyperpermeability via the TRL-4/caveolin-1 pathway[J].J Immunol，2014，193(10)：5000-5012.

[5] Sánchez-Aranguren LC，Prada CE，Ria o-Medina CE，et al.Endothelial dysfunction and preeclampsia：role of oxidative stress[J].Front Physiol，2014，5：372.

[6] Lash GE，Hornbuckle J，Brunt A，et al.Effect of low oxygen concentrations on trophoblast-like cell line invasion[J].Placenta，2007，28：390-398.

[7] Kilburn BA，Wang J，Duniec-Dmuchkowski ZM，et al.Extracellular matrix composition and hypoxia regulate the expression of HLA-G and integrins in a human trophoblast cell line[J].Biol Repro，2000，62：739-747.

[8] 张雅琪，吴媛媛，刘海意，等.缺氧调控滋养细胞MMP-9/TIMP-1 表达及侵袭能力的体外研究[J].现代妇产科进展，2014，23(2)：117-120.

[9] Li G，Zhang Y，Qian Y，et al.Interleukin-17A promotes rheumatoid arthritis synoviocytes migration and invasion under hypoxia by increasing MMP-2 and MMP-9 expression through NF-KB/HIF-1 A pathway[J].Mol Immunol，2013，53(3)：227-236.

国家自然科学基金资助项目(编号：30872774/H0418)；四川省卫生和计划生育委员会科研基金资助项目(编号：140071)

R446.11

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1672-6170(2015)05-0069-04

2015-04-30；

2015-06-20)