索氏提取法提取裂殖壶菌粉油脂参数的优化

张宪利，张 静，赵凤娟，赵自国

（1.滨州学院 生命科学系，山东 滨州 256603；2.中国海洋大学 海洋生命学院，山东 青岛 266003；3.山东省黄河三角洲野生植物资源开发利用工程技术研究中心，山东 滨州 256603）

索氏提取法提取裂殖壶菌粉油脂参数的优化

张宪利1，张 静2，赵凤娟3，赵自国3

（1.滨州学院 生命科学系，山东 滨州 256603；2.中国海洋大学 海洋生命学院，山东 青岛 266003；3.山东省黄河三角洲野生植物资源开发利用工程技术研究中心，山东 滨州 256603）

裂殖壶菌作为富含DHA的海洋真菌成为研究热点，但其干粉的油脂提取效率并不高，索氏提取法是能够提高油脂得率的方法之一。通过实验探讨了两种不同混合溶剂条件下，提取时间、藻粉量、水浴温度等因素对新旧两份裂殖壶菌藻粉材料油脂提取的影响，并通过正交试验分别确定了其最佳提取条件组合：有机萃取溶剂为1∶1等体积氯仿—甲醇混合溶剂，藻粉量1.0g，萃取时间2.5h，水浴温度95℃，得到新、旧藻粉的最高粗油脂提取率分别为81.70%和47.43%。在最佳条件下进行重复实验验证，发现优化后的索提方法油脂提取率高，可以有效甄别新旧菌粉，将为裂殖壶菌油脂提取工艺的优化及实际工业应用提供实验依据。

裂殖壶菌；油脂；索氏提取；参数优化

1 引言

裂殖壶菌（Schizochytriumsp.）俗称裂壶藻，是一类海洋真菌，属于真菌门（Eumycota）、卵菌纲（Oomycetes）、水霉 目 （Saprolegniales）、破 囊 壶 菌 科（Thraustochytriaceae），其形态特征为单细胞球形。裂殖壶菌目前已成为工业化生产DHA（二十二碳六烯酸，Docosahexaenoic Acid） 的 重 要 菌 种 来 源［1］。Schizochytrium细胞积累大量有用的活性物质，如：角鲨烯、色素和油脂等，其油脂含量占细胞干重的70%以上，主要由甾醇、色素等的不皂化物、极性脂和中性脂组成［2，3］，以甘油三酯为主的中性酯可占90%以上。总脂中DHA的含量高，可达35%～40%，容易分离纯化，且不含鱼油DHA特有的鱼腥味［4］。裂殖壶菌因富含油脂尤其是DHA已经成为当前国内外研究热点。

近年来对于裂殖壶菌的研究主要集中于菌种选育及对其培养方式的研究［5，6］、产脂肪酸的代谢机理研究［7～9］以及对其脂肪酸的提取方式的探索等方面，尤其下游油脂提取及精炼技术的研究备受关注［10，11］。综合相关报道，油脂提取得率因原料及方法差异而呈现明显差异；但针对特定菌种材料缺乏对具体提取工艺参数的优化研究，针对菌粉材料进行的油脂提取研究鲜有报道。索氏提取法，最早由德国农业化学家提出，已在生物油脂提取中有普遍的应用［12～14］，主要用于粗脂肪含量的测定，因其节省提取溶剂，且操作过程可控性好，具有较好的优化潜力和可行性。

本研究利用索氏提取法粗提裂殖壶菌菌粉中的脂质，并对其油脂提取参数加以优化，提出针对索氏提取真菌油脂提取方法的改良建议，从而为裂殖壶菌油脂提取工艺的优化及实际工业应用提供参考。

2 材料与方法

2.1 材料

实验材料见表1。

表1 藻粉材料信息

2.2 仪器及试剂

仪器：N－1000旋转蒸发仪（日本东京理化器械会社）、HH－S数显恒温水浴锅（金坛市医疗仪器厂）、202－1型电热干燥箱（济南洁康空气净化设备厂）、FA1204B分析天平（上海佑科仪器仪表有限公司）、索氏提取器、圆底烧瓶、搅拌器、移液管、具塞试管等玻璃容器若干；

试剂：氯仿、甲醇、乙醚、石油醚、正己烷、蒸馏水；1∶1等体积氯仿—甲醇混合溶液；1∶1等体积石油醚—乙醚混合溶液等。

2.3 方法

2.3.1 样品处理

分别取一定量新、旧藻粉，装入烧杯中，置于恒温干燥箱中于65℃条件下烘干至恒重（标准：两次之差＜0.0008g）。取出后置于干燥器中待用。

2.3.2 索氏提取法

具体操作流程参照相关文献［12，14］。选择1∶1等体积氯仿—甲醇混合溶液和1∶1等体积石油醚－乙醚混合溶液两种不同的溶剂条件下，分别控制提取时间、藻粉量、水浴温度等变量，进行单因素实验。根据单因素实验的结果，通过正交试验设计确定其油脂提取的最佳条件组合。

2.3.3 提油率的测定

采用减重法［15］。其计算公式为：

式中：P为样品中粗脂肪的提取率（%）；m2为索氏提取前样品滤纸筒的质量（g）；m3为索氏提取后样品滤纸筒的质量（g）；m1为样品菌粉中粗油脂的理论含量（g）：菌粉质量＊理论粗油脂含量。

3 结果与分析

3.1 旧藻粉在两种不同溶剂条件下的单因素实验

3.1.1 提取时间对粗油脂提取率的影响

不同提取时间条件下粗油脂提取率的变化较大，随着时间的增加，提取率逐步提高。然而，1∶1氯仿—甲醇混合溶剂条件下，当提取时间为2.5h时，其粗油脂提取率最高，提取时间达到3.0h时出现了提取率下降的现象。不同提取时间条件下，溶剂为1∶1氯仿—甲醇混合溶剂条件下的粗油脂提取率均明显高于1∶1石油醚—乙醚混合溶剂（图1）。

图1 不同提取时间对粗油脂得率的影响

3.1.2 藻粉质量对粗油脂提取率的影响

1∶1氯仿—甲醇混合溶剂条件下，藻粉质量对粗油脂提取率的影响较大；粗油脂提取率随着藻粉量的增加，呈现先升高后降低的趋势；在该设定条件下，当藻粉量为1.5g时，粗油脂提取率最高；1∶1氯仿—甲醇混合溶剂条件下的粗油脂提取率均高于1∶1石油醚—乙醚混合溶剂（图2）。

图2 不同藻粉量条件下索氏提取法提取的粗脂得率

3.1.3 水浴温度对粗油脂提取率的影响

1∶1氯仿—甲醇混合溶剂条件下，粗油脂提取率伴随水浴温度的增加而增高，当水浴温度设定为95℃左右时，粗油脂提取率最高（图3）。而1∶1石油醚—乙醚混合溶剂条件下，则呈现先增加后降低的趋势。

图3 不同水浴温度条件下索氏提取法提取的粗脂得率

通过各单因素实验对比发现，1∶1等体积氯仿—甲醇混合溶剂条件下的粗油脂提取率均优于1∶1等体积石油醚—乙醚混合溶剂，因此，后续仅设计1∶1等体积氯仿—甲醇混合溶剂条件下的正交优化实验。

3.2 氯仿—甲醇混合溶剂条件下旧藻粉的油脂提取正交优化实验

在单因素实验的基础上，选择藻粉量（A）、提取时间（B）和水浴温度（C）为考察因素，进行L9（3）3正交试验，因素水平设计见表2，正交实验情况见表3。

表2 油脂提取条件优化正交实验因素与水平Ⅰ

表3 旧藻粉油脂提取条件优化正交实验Ⅱ

实验结果表明：三个因素对裂殖壶菌粗脂得率的影响大小是：C＞B＞A，即水浴温度的影响最大，提取时间影响其次，藻粉量的影响最小。综合各因素考虑，最佳的油脂提取条件组合为A1＋B2＋C2，即：有机萃取溶剂为1∶1等体积氯仿－甲醇混合溶剂，藻粉量1.0g，提取时间2.5h，水浴温度95℃时，粗油脂提取率最高。

将正交试验获得的粗油脂得率最佳条件组合进行重复实验验证，3次平行实验得出的提油率平均值为47.43%。

3.3 氯仿—甲醇混合溶剂条件下新藻粉的油脂提取正交优化实验

选用新藻粉，同样进行L9（3）3正交试验，因素水平设计参见表2，正交实验情况见表4。

表4 新藻粉油脂提取条件优化正交实验Ⅱ

三个因素对裂殖壶菌粗脂得率的影响大小是：C＞A＞B，即水浴温度的影响最大，藻粉质量影响其次，提取时间的影响最小。综合各因素考虑，最佳的油脂提取条件组合为A1＋B2＋C2，即：藻粉量1.0g左右，提取时间2.5h，水浴温度95℃的提取条件下，粗油脂提取率最高。

将正交实验获得的最佳提取条件的组合进行重复实验验证，3次平行实验得出的提油率平均值为81.70%。

3.4 新旧藻粉粗油脂提取率的比较

通过新旧藻粉的正交实验，比较其各自在最佳提取条件组合下的粗油脂得率，发现新藻粉的粗油脂提取率（81.70%）明显高于旧藻粉（47.43%）；但新旧藻粉二者的最佳提取条件组合相同。

4 结论与讨论

实验通过索氏提取方法从裂殖壶菌干藻粉提取油脂。在两种不同的等体积混合溶剂下，分别以提取时间、藻粉量和水浴温度为单因素控制条件，通过单因素实验得出其粗油脂提取率，进而通过正交实验得出最佳的油脂提取参数组合，实现对索氏提取法提取条件的优化，并将其用于藻粉鉴别。

萃取有机溶剂为1∶1等体积氯仿—甲醇混合溶剂，藻粉量1.0g左右，提取时间2.5h，水浴温度95℃时，粗油脂提取率最高，可达81.7%，实现了对其的技术优化。当萃取有机溶剂为1∶1等体积石油醚—乙醚混合溶剂时，各项单因素实验结果均不及前者。分析可能是该组合的沸点较低，而水浴温度过高时容易造成乙醚的过度挥发，使混合溶剂不呈现1∶1等体积混合，对提取造成不良影响。

新旧藻粉分别在各自的最佳提取条件组合下，新藻粉的粗油脂提取率（81.70%）明显高于旧藻粉（47.43%），可通过索氏提取比较藻粉的油脂得率来甄别新旧藻粉。分析原因可能是旧藻粉放置时间太长，加之发酵培养基不同，菌种组成可能存在差异，也可能与不同批次的菌粉添加比例不同有关。

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Optimization the Parameter of Grease Extraction From Schizochytrium Limacinum Powder Based on Soxhlet Method

Zhang Xianli1，Zhang Jing2，Zhao Fengjuan3，Zhao Ziguo3
（1.DepartmentofLifeSciences，BinzhouUniversity，Binzhou256603，China；2.CollegeofMarineLife，OceanUniversityofChina，Qingdao266003，China；3.EngineeringTechnologyResearchCenterofDevelopment andUtilizationofWildPlantResourcesinYellowRiverDeltainShandongProvince，Binzhou256603，China）

Schizochytrium has become one of the research hotspots of marine fungi for its high contents of DHA，while the oil grease extraction efficiency of schizochytrium powder is not high.The soxhlet extraction method is recognized as an effective way to improve the extraction efficiency.Under the condition of two mixed solvent，the article discusses the effect of extraction time，amount of powder and temperature on grease extraction from the new and old schizochytrium powder.In addition，the optimal extraction condition has been determined through the experiment and the orthogonal experiment.The results show that when the organic solvent is mixed by equal volume of chloroform and methanol，the amount of algae powder is 1.0g，extraction time is 2.5h，and temperature is 95℃，the extraction rate of grease is the highest，being 81.70%for new and 47.43%for old powder material.Through repeated experimental verification under the optimal condition，the article finds out that this optimized processing is effective in improving grease extraction rate and powder discrimination，which will provide useful references for grease extraction and future industrial application.

schizochytrium limacinum；grease；soxhlet extraction；parameter optimization

TS224

A

1674－9944（2015）08－0294－04

2015－06－17

国家级大学生创新训练计划（编号：201310449125）；山东省自然科学基金（编号：ZR2011DL012）；滨州学院科研项目（编号：2012ZDL04；BZXYFB20130706）资助

张宪利（1992—），男，山东泰安人，滨州学院生命科学系大学生。

赵凤娟（1981—），女，山东青州人，副教授，博士，主要从事海洋生物技术研究。