伪狂犬病病毒gB基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

王 雨，吉艺宽，程 艺，张宝石，向柯宇，琚春梅

（华南农业大学兽医学院，广东广州 510642）

伪狂犬病（Pseudorabies，PR）是由伪狂犬病病毒（Pseudorabiesvirus，PRV）引起的动物以发热、奇痒、脑脊髓炎为主要特征的传染病，猪为其储存宿主，并可引起猪的潜伏感染。本病在世界范围内广泛流行，给世界养猪业造成了巨大的经济损失［1-2］。我国从20世纪90年代开始在规模化猪场广泛使用PRV基因缺失疫苗，很好地控制了该病造成的危害，但自2011年以来，该病又有暴发流行趋势，因此加强该病的防控对我国养猪业的健康发展至关重要。

PRV基因组为线状双链DNA，大小约为180 kb，G＋C含量高达74%，可以编码70种蛋白，其中糖蛋白有gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gK、gL、gM、gN 11种［3］。gB作为病毒的一个重要囊膜组分和中和抗原，对于病毒的感染起到重要作用，并参与病毒特异性体液免疫和细胞免疫［4］。gB基因属于疱疹病毒中保守的糖蛋白基因，编码913个氨基酸，gB蛋白分别在59-126aa、214-289aa、507-734aa处存在优势抗原表位，其中59-126aa之间有3个连续的抗原表位，在214-279aa之间有一个连续的抗原表位，在540-734aa区间有8个潜在的非连续抗原表位［4］。根据gB基因的以上特点，本研究针对其中的优势抗原表位，应用PCR扩增gB基因的主要抗原表位区，构建原核表达质粒，并在大肠埃希菌中进行表达，利用表达蛋白作为抗原建立gB768-ELISA诊断方法，为伪狂犬病疫苗免疫效果的评估提供技术方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒及菌株 伪狂犬病病毒，大肠埃希菌TOP10及BL21（DE3），表达载体pET-32a（＋）均由华南农业大学兽医微生物学与免疫学教研室保存。

1.1.2 工具酶和试剂 LATaq酶、限制性内切酶（BamHⅠ、HindⅢ）、T4DNA 连接酶、DNA Marker、IPTG、琼脂糖均为宝生物工程（大连）有限公司产品；蛋白质Marker为Fermentas公司产品；DNA凝胶回收试剂盒及质粒抽提试剂盒为Omega公司产品；HisTrapFF crude预装柱为GE公司产品；羊抗猪IgG-HRP为广州健阳生物技术有限公司产品；伪狂犬病毒阳性血清、阴性血清及口蹄疫病毒（FMDV）、猪瘟病毒（CSFV）、日本脑炎病毒（JEV）、猪圆环病毒2型（PCV-2）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）阳性血清由华南农业大学微生物学与免疫学教研室保存；128份临床血清样本为猪场送检；PRV gB抗体检测试剂盒为美国IDEXX公司产品。

1.2 方法

1.2.1 gB768的PCR扩增 参考GenBank登录的伪狂犬病毒gB序列（序列号A 68929），设计一对引物扩增gB基因主要抗原表位区。引物如下：gB-F：5′-CGCGGATCCGCGCTGCTGCTGCTGGC-3′（下划 线 部 分 为BamH Ⅰ 酶 切 位 点 ），gB-R：5′-CCCAAGCTTGGCGAAGGAGTCGTAGGGGTA-3′（下划线部分为HindⅢ酶切位点），利用PCR扩增包含59-289aa优势抗原表位区基因序列，大小为768bp，命名为gB768。

PCR反应参数：95℃5min；95 ℃35s，53℃45s，72℃1min，30个循环；72℃10min。该PCR反应以抽提的猪伪狂犬病毒的DNA作为模板扩增，产物经10g／L琼脂糖凝胶进行电泳检测并回收。

1.2.2 重组表达质粒的构建 用HindⅢ和BamHⅠ双酶切PCR产物，连接经同样双酶切处理的pET-32a（＋），转化到TOP10感受态细胞。提取质粒并对其应用酶切和PCR两种方法鉴定，对鉴定正确的重组质粒由生工生物工程（上海）股份有限公司进行基因序列测定，测定正确的重组质粒命名为pET-gB768。

1.2.3 重组蛋白的表达、纯化及 Western blot鉴定阳性重组质粒pET-gB768转化大肠埃希菌BL21（DE3）。最佳诱导条件下表达目的蛋白，经 His-TrapFF crude预装柱纯化后，采用SDS-PAGE电泳和 Western blot进行检测［5］。

1.2.4 间接gB-ELISA检测方法的建立

1.2.4.1 反应条件的优化 方阵滴定法确定重组蛋白gB的最佳包被浓度及血清的最佳稀释度，并对封闭液的选择及其作用时间，二抗稀释度及其作用时间，TMB显色时间分别进行优化。

1.2.4.2 判定标准的确定 取30份PRV阴性猪血清样本，用建立的间接gB768-ELISA方法检测，以30份血清的平均OD 450nm值＋3×SD作为判定阴阳性的临界值。

1.2.4.3 特异性试验 用建立的间接gB768-ELISA方法检测PRRSV、CSFV、JEV、PCV-2、FMDV标准阳性血清。同时设猪伪狂犬病毒阳性血清、阴性血清对照，判定血清交叉反应情况。

1.2.4.4 敏感性试验 将PRV阳性血清作平行倍比稀释，用建立的间接gB768-ELISA方法检测血清中抗体的含量并判定其抗体检出效价。

1.2.4.5 重复性试验 取5份抗体水平不同的血清，用8块不同批次包被的酶标板按优化的ELISA操作程序进行试验，通过OD 450nm值计算变异系数确定方法的批间重复性。另取5份抗体水平不同的血清，在包被的同一批次酶标板中按优化ELISA操作程序进行试验，样品每份重复8个孔，通过OD 450nm值计算变异系数确定方法的批内重复性。

1.2.4.6 临床样品检测 使用间接gB768-ELISA方法对不同猪场送检的128份猪血清样本进行检测，并与商品化ELISA试剂盒检测结果进行比较分析。

2 结果

2.1 PCR扩增及重组表达质粒构建

经PCR扩增出大小约为768bp的目的条带（图1）。重组质粒pET-gB768经BamHⅠ、HindⅢ双酶切后，可得到约768bp和约5 800bp两个片段，与预期结果相符（图2），基因序列测定结果与参考的序列一致。

图1 PRV gB768PCR扩增结果Fig.1 Amplification of gB768of PRV by PCR

图2 重组质粒pET-gB768的酶切鉴定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pET-gB768 by enzyme digestion

2.2 表达产物的SDS-PAGE电泳及 Western blot分析

重组质粒pET-gB768转化大肠埃希菌BL21（DE3），经诱导后进行SDS-PAGE电泳，表达蛋白大小约为47ku。通过HisTrapFF crude预装柱亲和层析对重组蛋白进行纯化，Western blot结果表明目的蛋白可与PRV阳性血清反应（图3和图4），具有良好的反应原性。

图3 重组蛋白的SDS-PAGE分析Fig.3 Identification of the recombinant protein by SDS-PAGE

2.3 间接gB768-ELISA最佳反应条件的确定

经过方阵滴定确定重组抗原最佳包被浓度为2 μg／mL，阴、阳性血清的最佳稀释度为1∶320，作用时间为37℃50min；最佳封闭液为10mL／L的BSA，封闭时间为37℃2h；二抗的最佳稀释度为1∶5 000，作用时间为37℃1h；底物最佳显色时间为室温15min。

2.4 判定标准的确定

用建立的间接gB768-ELISA检测30份阴性血清，计算出平均OD450nm＝0.111，标准差SD＝0.034，从而计算出阴阳临界值为0.213，因此，若样本OD450nm 值≥0.213，判定为阳性；若样本OD450nm值＜0.213，判定为阴性。

图4 重组蛋白的Western blot分析Fig.4 Identification of the recombinant protein by Western blot

2.5 特异性试验

用建立的间接gB768-ELISA方法检测PRV、FMDV、PRRSV、JEV、CSFV、PCV-2标准阳性血清，结果显示除猪伪狂犬病病毒阳性血清为阳性外，其余血清的OD450nm均低于0.213，判定为阴性，表明本试验建立的gB768-ELISA方法对PRV有良好的特异性（表1）。

2.6 敏感性试验

用建立的间接gB768-ELISA方法检测PRV标准阳性血清，血清稀释1∶6 400时，检测结果仍为阳性（OD 450nm＝0.307）（表2），表明建立的方法敏感性良好。

表1 间接gB768-ELISA方法特异性试验Table 1 The specificity test of indirect gB768-ELISA

表2 间接gB768-ELISA方法敏感性试验Table 2 The sensitivity test of indirect gB768-ELISA

2.7 重复性试验

利用建立的间接gB768-ELISA方法对5份血清进行批内重复性试验，结果（表3）显示变异系数小于10%，用8块不同批次的酶标板对5份血清进行批间重复性试验，结果（表4）显示变异系数小于10%，表明所建立的gB768-ELISA检测方法具有较好的重复性。

表3 间接gB768-ELISA方法批内重复性试验Table 3 The intra repeatability test of indirect gB768-ELISA

表4 间接gB768-ELISA检测方法批间重复性试验Table 4 The inter repeatability test of indirect gB768-ELISA

2.8 临床样品检测

利用建立的间接gB768-ELISA方法检测不同猪场送检的128份猪血清样本，并与商品化ELISA试剂盒检测结果进行比较（表5）。从表5中可以看出，用IDEXX ELISA试剂盒检测为阳性的114份血清中，间接gB768-ELISA检出106份阳性，阳性符合率为93.0%（106／114）；IDEXX ELISA 试剂盒检测为阴性的14份血清中，间接gB768-ELISA检14份阴性，阴性符合率为100%；间接gB768-ELISA检测方法与IDEXX ELISA试剂盒的总符合率为93.8%（（106＋14）／128）。

表5 临床样品检测结果Table 5 The detection result of clinical samples by gB768-ELISA and IDEXX ELISA Kit

3 讨论

20世纪90年代起，PRV基因缺失疫苗在全国得到推广使用，使伪狂犬病总体上得到了控制［6-7］，但自2011年以来我国多省报道新生仔猪出现神经症状和死亡的现象，经PCR检测均为伪狂犬病病毒野毒的感染［8-9］。对分离病毒的生物学特性进行分析，结果表明新分离毒株与以前分离株的遗传关系较远并且毒力更强，现阶段使用的Bartha-K61弱毒疫苗免疫猪后产生的中和抗体对新分离毒株的中和能力较差［9-12］，表明新分离株可能存在一定抗原变异。

gB糖蛋白是PRV的主要囊膜糖蛋白，在PRV病毒的感染中必不可少，同时它还在膜融合中起重要作用，介导病毒穿入过程中囊膜与细胞膜的融合，以及介导感染细胞与非感染细胞之间细胞膜的融合［13-14］。此外在PRV感染中，gB也是诱导机体产生免疫应答的重要糖蛋白之一，不仅可以刺激机体产生补体依赖性和补体非依赖性中和抗体，也可以刺激淋巴细胞增殖及参与LAK细胞的细胞毒作用。Xuan x等［15］研究表明，经gB蛋白免疫的小鼠能够抵抗PRV的致死性攻击。

PRV gB蛋白的主要抗原表位存在于59-129aa、214-289aa、507-734aa处。包新奇等［16］通过对三段抗原表位区分段表达并与PRV阳性血清反应发现，在214-289aa、507-734aa处有较好的抗原性。本试验应用大肠埃希菌表达系统分别表达了gB基因主要抗原表位区59-289aa及507-734aa，通过ELISA检测发现59-289aa抗原表位区与PRV阳性血清的反应原性比507-734aa更好。因此本试验选择59-289aa抗原表位区作为诊断抗原建立间接ELISA诊断方法。

本研究建立的gB768-ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性及可重复性，且与IDEXX gBELISA试剂盒符合率可达到93.8%，应用前景良好。通过gB768-ELISA方法可以对伪狂犬病疫苗的免疫效果进行评估，以便猪场制定正确的免疫程序，增加对新一轮伪狂犬病暴发的抵抗力。目前，在PRV净化时猪场普遍采用gE-ELISA试剂盒区分疫苗免疫猪和野毒感染猪，但gE抗体阴性猪可能为疫苗免疫合格猪，也可能为免疫失败猪，必须同时检测PRV gB抗体才能进一步判定疫苗免疫是否合格。因此，通过PRV gE与gB抗体检测试剂盒联合使用更有利于猪场PRV的净化。

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