制何首乌水提液对小鼠成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化及OPG-RANKL mRNA表达的影响

范迎赛，李 琴，高宗勤，范 开，刘钟杰

（中国农业大学动物医学院，北京 100193）

制何首乌为蓼科植物何首乌（PolygonummultiflorumThunb.）干燥块根的炮制加工品，味苦、甘、涩，性微温，归肝、心、肾经，具有补肝肾、益精血、壮筋骨的功效［1］。制何首乌对骨质疏松症具有一定的防治作用［2］，但其调节骨代谢的作用机制尚不清楚。

骨代谢活动包括成骨细胞介导的骨基质沉积与破骨细胞介导的骨吸收，骨吸收大于骨沉积即易出现骨质疏松［3］。碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）是成骨细胞分化成熟的早期标志之一［4］，与骨基质形成密切相关［5］；骨保护素（osteoprotegerin，OPG）和 核因子κB受体活化因子配体（receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL）是成骨细胞调节破骨细胞增殖分化的重要因子，与骨吸收活动相联系［6］。本试验通过研究不同浓度制何首乌水提液对体外培养小鼠成骨细胞 MC3T3-E1增殖、ALP分泌和 OPG／RANKL mRNA 表达的影响，探索制何首乌调节骨代谢可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物及主要试剂 制何首乌饮片为北京同仁堂马连洼药店产品；α-MEM培养基、青-链霉素溶液为Hyclone公司产品；胎牛血清（FBS）为Gibico公司产品；噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）为Sigma公司产品；碱性磷酸酶（ALP）活力检测试剂盒为南京建成公司产品；细胞RNA提取试剂盒为艾德莱公司产品；RNA反转录试剂盒、PCR试剂盒、p-EASY-T3Cloning Kit、质粒 DNA 小量提取试剂盒、胶回收试剂盒、qPCR试剂为全式金公司产品。

1.1.2 细胞株 小鼠成骨细胞株MC3T3-E1为中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心产品。

1.2 方法

1.2.1 制何首乌水提液的制备 取100g制何首乌饮片常规煎煮2次，浓缩至1g／mL，置-20℃保存备用。用前过滤除菌，使用含50mL／L FBS的α-MEM培养基配制为不同浓度的制何首乌培养液（0、10-4、10-5、10-6、10-7和10-8g／mL）。

1.2.2 MC3T3-E1细胞相对增殖率的检测 将MC3T3-E1细胞接种于96孔板，待细胞完全贴壁后，随机分组，将细胞分别作用于100μL不同浓度的制何首乌培养液中。加药44h或68h后于各孔加入30μL 5g／mL MTT，4h后弃去培养液，于各孔加入150μL DMSO，避光振荡混匀15min，于酶标仪570nm处检测OD值。细胞相对增殖率＝试验组OD值／对照组OD值×100% 。

1.2.3 MC3T3-E1细胞ALP蛋白表达的检测 细胞培养同1.2.2，加药2d及6d后，收集细胞上清，按照ALP活力检测试剂盒（微板法）说明书进行操作。其原理为ALP可分解磷酸苯二钠，产生的游离酚在碱性溶液中与4-氨基安替吡啉作用，经铁氰化钾氧化生成红色醌衍生物，可于酶标仪520nm波长下进行检测。细胞培养液中ALP活力＝（试验组OD值／对照组OD值）×标准品浓度（0.1mg／mL）×100mL

1.2.4 MC3T3-E1细胞 OPG、RANKL mRNA 表达的检测

1.2.4.1 标准曲线的制备 按照说明书进行MC3T3-E1细胞总RNA的提取及反转录，PCR产物跑胶及切胶回收，载体连接、转化和菌株测序。提取测序阳性菌质粒，分别10倍递增稀释8组，采用荧光PCR三步法制作标准曲线。普通PCR及荧光PCR退火温度均为60℃，引物序列见表1。

表1 MC3T3-E1细胞OPG、RANKL和β-actin引物序列Table 1 Sequence of primers of OPG，RANKL andβ-actin for MC3T3-E1cells

1.2.4.2 OPG、RANKL mRNA 表达的检测 将MC3T3-E1细胞接种于6孔板，待细胞完全贴壁后，将细胞分别作用于4mL不同浓度的制何首乌培养液中。1d后，按照说明书提取细胞总RNA并进行反转录。以反转录得到的cDNA为模板，采用实时定量PCR三步法对不同处理组样本OPG、RANKL和β-actin基因进行检测。

2 结果

2.1 MC3T3-E1细胞增殖

MC3T3-E1细胞增殖率检测结果见图1。药物作用2d及3d后，10-4～10-8g／mL浓度制何首乌水提液均可极显著促进MC3T3-E1细胞增殖（P＜0.01）。

图1 不同浓度制何首乌水提液对MC3T3-E1细胞增殖率的影响（n＝5）Fig.1 Effect of different concentrations of Radix Polygoni Multiflori Preparata water extracts on proliferation rate of MC3T3-E1cells（n＝5）

2.2 MC3T3-E1细胞ALP蛋白的表达

MC3T3-E1细胞ALP蛋白表达检测结果见图2。药物作用2d后，10-4g／mL浓度制何首乌水提液可显著促进MC3T3-E1细胞分泌ALP蛋白（P＜0.05），10-5和10-6g／mL 浓度制何首乌水提液对MC3T3-E1细胞分泌ALP蛋白无明显影响（P＞0.05）；作用6d后，10-4、10-5、10-6g／mL浓度制何首乌水提液均可极显著促进MC3T3-E1细胞分泌ALP蛋白（P＜0.01）。

图2 不同浓度制何首乌水提液对MC3T3-E1细胞分泌ALP的影响（n＝3）Fig.2 Effect of different concentrations of Radix Polygoni Multiflori Preparata water extracts on ALP secretion of MC3T3-E1cells（n＝3）

2.3 实时荧光定量PCR检测结果

2.3.1 PCR标准曲线 目的基因PCR扩增产物与目的片段大小相符，阳性克隆测序结果与原始序列100%同源；目的基因荧光PCR扩增产物溶解曲线主峰单一，无异常增宽，说明引物特异性良好；OPG和RANKL标准曲线相关系数分别为0.998 0与0.999 0，说明设计引物扩增效率一致。

2.3.2 OPG、RANKL mRNA表达的检测 OPG、RANKL mRNA表达的检测结果见图3。药物作用1d后，10-4g／mL浓度制何首乌水提液可显著提高MC3T3-E1细胞OPG／RANKL mRNA表达比（P＜0.05），10-5g／mL 浓度制何首乌水提液可极显著提高 MC3T3-E1细胞 OPG／RANKL mRNA表达比（P＜0.01），10-6、10-7、10-8g／mL浓度制何首乌水提液对MC3T3-E1细胞OPG／RANKL mRNA表达比无明显影响 （P＞0.05）。

图3 不同浓度制何首乌水提液对MC3T3-E1细胞OPG／RANKL mRNA 比值的影响（n＝3）Fig.3 Effect of different concentrations of Radix Polygoni Multiflori Preparata water extracts on OPG／RANKL mRNA ratio of MC3T3-E1cells（n＝3）

3 讨论

骨基质沉积包括成骨细胞分化增殖、基质形成和基质钙化3个时期，ALP活性增高是成骨细胞分化的早期标志和骨基质形成期的特征性表现［4］。MTT检测结果显示，各浓度制何首乌水提液作用MC3T3-E1细胞2d～3d后均可极显著上调细胞增殖率，说明制何首乌水提液具有促进细胞增殖的作用。ALP检测结果显示，制何首乌水提液作用细胞2d后，高浓度可显著促进MC3T3-E1细胞培养上清中ALP活力，低浓度无明显作用，说明高浓度制何首乌水提液具有促MC3T3-E1细胞分化的作用；作用细胞6d后，各浓度均可极显著促进MC3T3-E1细胞培养上清中ALP活力，说明随着时间的延长，低浓度的制何首乌水提液也发挥出促MC3T3-E1细胞分化的作用。

破骨细胞是动物机体唯一专职骨吸收的细胞［7］，成骨细胞通过分泌OPG和RANKL调控破骨细胞活动［8］。RANKL与破骨祖细胞表面的核因子κB受体活化因子（RANK）结合后，募集和激活细胞质内肿瘤坏死因子相关因子，促进破骨祖细胞分化为破骨细胞［9］，提高破骨细胞骨吸收活性［6］。OPG属于肿瘤坏死因子受体超家族，可结合RANKL并抑制其通过结合RANK发挥的促进破骨细胞增殖分化的作用，从而抑制骨吸收［10］。荧光定量PCR结果显示，高浓度制何首乌水提液能够提高MC3T3-E1细胞OPG／RANKL mRNA表达比，说明高浓度的制何首乌水提液可能通过上调成骨细胞OPG／RANKL表达比的途径抑制破骨细胞增殖分化。有研究发现一定浓度的制何首乌醇提物可抑制体外培养大鼠破骨细胞增殖及分化［11］，推测制何首乌可通过直接作用于破骨细胞和成骨细胞分泌细胞因子间接作用于破骨细胞两个途径抑制破骨细胞增殖分化。

制何首乌的化学成份主要有蒽醌类化合物（大黄酚、大黄素、大黄酸等）、二苯乙烯苷类化合物、黄酮类化合物、磷脂类化合物和多糖等［12］，有研究发现何首乌、大黄素和二苯乙烯苷均具有雌激素样作用［13］。雌激素具有调节骨代谢的作用，可以促进成骨细胞增殖、ALP活性和OPG／RANKL mRNA表达比［14］。本试验中，高浓度制何首乌对 MC3T3-E1细胞的作用是否与其具雌激素样作用的成份相关，需要进一步的研究。

综上所述，一定浓度的制何首乌具有促进成骨细胞增殖分化和抑制破骨细胞增殖分化的作用，产生作用的分子机制与ALP及OPG／RANKL系统相关。

［1］尹成杰，于康震，贾幼陵，等.中华人民共和国兽药典（二部）［M］.北京：中国农业出版社，2010：236-239.

［2］楼招欢，吕圭源，俞静静.何首乌成分、药理及毒副作用相关的研究进展［J］.浙江中医药大学学报，2014，38（4）：495-500.

［3］Nardone V，D＇Aats F，Brandi M L.Pharmacological management of osteogenesis［J］.Clinics，2014，69（6）：438-446.

［4］刘继平，程 玥.中药促进成骨细胞功能和ALP活性影响的研究意义［J］.陕西中医学院学报，2010，33（1）：7-8.

［5］Sharma U，Pal D，Prasad R.Alkaline phosphatas：An overview［J］.Indian J Clin Biochem，2014，29（3）：269-278.

［6］吴 垠，赵承斌.OPG／RANK／RANKL系统与祖国传统医药［J］.中国医药导报，2012，9（10）：134-136.

［7］仝锡帅，顾建红，刘宗平.整合素及其调控破骨细胞相关信号机制研究进展［J］.动物医学进展，2013，34（5）：99-102.

［8］胡泽兵，曹新生，张 舒.成骨细胞体外培养技术［J］.中国骨质疏松杂志，2014，20（11）：1276-1283.

［9］王 东，顾建红，刘宗平.组织蛋白酶K在骨吸收中的作用研究进展［J］.动物医学进展，2014，35（6）：114-116.

［10］Martin T J，Sims N A.RANKL／OPG；Critical role in bone physiology［DB／OL］.http：／／link.springer.com／article／10.1007／s11154-014-9308-6＃page-1，2015-02-04.

［11］程孟春，刘艳秋，王 莉，等.何首乌和菟丝子对破骨细胞和成骨细胞增殖及分化的影响［J］.中国中药杂志，2011，36（19）：2737-2740.

［12］赵 炜，赵树进.何首乌研究现状［J］.中华中医药学刊，2014，32（5）：1128-1134.

［13］杨利娟.何首乌、骨碎补和淫羊藿抗骨质疏松的作用机理研究［D］.四川成都：成都中医药大学，2012.

［14］Xiao H H，Fung C Y，Mok S K，et al.Flavonoids from Herba epimedii selectively activate estrogen receptor alpha（ERα）and stimulate ER-dependent osteoblastic functions in UMR-106 cells［J］.J Steroid Biochem Mol Biol，2014，143：141-151.