猪传染性胃肠炎病毒N蛋白在猪小肠黏膜上皮细胞中的表达及对细胞周期的影响

常 嵘，张 琪，何亚鹏，童德文，许信刚

（西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100）

猪传染性胃肠炎（Transmissible gastroenteritis，TGE）是由猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）引起的一种2周龄以内仔猪高度接触性、致死率达可100%的肠道传染病，临床症状为呕吐、严重腹泻和脱水性肠炎［1］。在病毒性腹泻流行与发生时，常存在以PEDV／RV／TGEV、PEDV／RV为主的混合感染［2］，且混合感染对机体的损伤比单一感染更为严重［3］。猪传染性胃肠炎被列入OIE猪病名录，是我国重点防控的疾病之一，其发生主要在春、秋两季［4］。猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）属于冠状病毒科冠状病毒属成员，该病毒为有囊膜不分节断的单股正链RNA病毒［5］。3′端有Poly（A）尾，5′端帽子与一个短序列相连；基因组长约28.5kb，包括7个功能基因，编码4种结构蛋白（纤突蛋白S、外膜蛋白sM、膜蛋白M和核衣壳蛋白N）和3种非结构蛋白（ORF1、ORF3和ORF7），按 基 因 组 排 序 为 5′-ORFla-ORFlb-SORF3a-ORF3b-sM-M-N-ORF7-3′［6］。TGEV N 基因全长1 149bp，编码382个氨基酸。N蛋白是一种磷酸化的酸性蛋白，与病毒基因组RNA紧密结合组成核蛋白核芯。N蛋白诱导机体产生细胞免疫，同时在RNA的复制加工过程中起重要作用［7］。N蛋白通过活化p53信号通路参与TGEV诱导的细胞凋亡［8］。但是关于TGEV N 蛋白对细胞周期的影响目前研究较少，本研究旨在鉴定TGEV N蛋白在猪小肠上皮细胞 （swine intestinal epithelial cell，SIEC）中的表达并对细胞周期的影响，为下一步深入研究TGEV N蛋白的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒与细胞 pEGFP-N1-N载体由西北农林科技大学动物医学院兽医病理学实验室构建保存［9］；猪小肠上皮细胞（SIEC）由西北农林科技大学动物医学院张彦明教授实验室建系并提供［10］。

1.1.2 主要试剂 琼脂糖、RNase A 为Sigma公司产品；TaqDNA聚合酶、dNTP为Fermentas公司产品；DNA Marker DL 2 000为大连 TaKaRa公司产品；M-MLV逆转录酶为Promega公司产品；高纯度质粒小量提取试剂盒、DNA凝胶回收纯化试剂盒为Vigorous公司产品；Trizol Regent试剂盒、DMEM培养基、胰酶、新生牛血清（NCS）为Gibco公司产品；DMEM／F-12为Thermo公司产品；胎牛血清（FBS）为天杭生物科技有限公司产品；鼠抗GFP单克隆抗体、PVDF膜为Millipore公司产品；HRP标记的羊抗鼠IgG为武汉博士德公司产品；RIPA裂解液为Solarbio公司产品；高灵敏型ECL发光剂为康为世纪公司产品；抗TGEV N蛋白多克隆抗体由西北农林科技大学动物医学院病理兽医实验室制备。

1.2 方法

1.2.1 重组质粒转染SIEC

1.2.1.1 细胞培养 猪小肠上皮细胞（SIEC）以DF12培养液，添加100mL／LFBS，37℃、体积分数为5%CO2条件下培养。

1.2.1.2 细胞转染 转染前24h，胰酶消化SIEC并计数，以5×105个细胞／孔密度接种6孔板，培养24h左右细胞达到70%～90%的汇合度，将质粒pEGFP-N1、pEGFP-N1-N按Lipofectamine转染试剂盒说明进行转染，转染6h后更换含100mL／L小牛血清的DF12培养基继续培养，同时用未加转染液的细胞作对照。

1.2.2 蛋白表达的鉴定

1.2.2.1 RT-PCR鉴定 采用氯仿-异戊醇方法，从细胞培养物中提取细胞的总RNA。RT体系：RNA模板 2μL，dNTPs 2μL，下游引物 2μL，DEPC水4μL，70℃作用5min。然后，向体系中加入5×RT buffer 5μL，RNase inhibitor 0.2μL，MMLV 0.5μL，DEPC水9.3μL。37℃孵育60min，95℃10min，4℃10min。PCR体系：10×PCR buffer 2.5μL，MgCl2，dNTPs各2μL，上、下游引物（20pmol／μL）各0.5μL，cDNA 2μL，TaqDNA polymerase 0.2μL，灭菌双蒸水15.3μL。PCR程序：95 ℃ 5min；94 ℃ 30s，56 ℃ 1min，72 ℃1min，30个循环；72℃10min。引物序列和产物大小见表1。引物由金斯瑞公司合成。

1.2.2.2 Western blot鉴定 收集瞬时转染细胞及对照组细胞，PBS洗3次，加入适量的RIPA裂解液，冰上裂解30min，12 000r／min离心10min，取上清，加入1／4体积的4×Loading buffer，煮沸10min。120g／L SDS-PAGE电泳分离胶和50g／L SDS-PAGE电泳浓缩胶上样，电泳。将分离胶切下，转印至PVDF膜，转膜结束后，将PVDF膜放入含50g／L脱脂奶粉的PBS封闭液内室温封闭2h。封闭结束后，加入1∶500稀释的鼠抗N蛋白单克隆抗体4℃过夜孵育，洗膜后以1∶10 000的HRP标记的羊抗鼠IgG室温反应1.5h，洗去二抗后用ECL显色，在暗室用X射线胶片显影。

表1 PCR引物序列Table 1 Sequences of primers used for PCR

1.2.3 流式细胞仪检测细胞周期变化 收细胞样品，胰酶消化细胞，培养基终止消化，1 000r／min离心3min，PBS液洗3次；然后750mL／L无水乙醇固定细胞，4℃静置5d～7d；预冷PBS洗细胞2次，用1mL碘化丙啶（propidium iodide，PI）染液重悬细胞，吹散，染色30min～120min，然后上机测样。并用SIEC-pEGFP细胞株和正常SIEC作为对照。

2 结果

2.1 重组质粒转染到SIEC

真核表达载体pEGFP-N1-N转染到SIEC，转染48h后于倒置荧光显微镜下观察。结果表明，融合蛋白EGFP-N在细胞质中表达，对照组EGFP在细胞中表达 （图1）。

图1 重组质粒在SIEC中的表达Fig.1 pEGFP-N1-N expression in SIEC

2.2 N基因的RT-PCR鉴定

从细胞株中提取细胞总基因组的RNA，合成cDNA后，PCR鉴定目的基因。结果表明，扩增出约1 149bp的N基因片段，与预期大小一致，说明N基因已经整合到细胞的基因组中（图2）。

图2 N基因的RT-PCR检测结果Fig.2 RT-PCR detection results of N gene

2.3 N蛋白 Western blot检测

从细胞株中提取总蛋白进行 Western blot检测，结果检测到了预期70ku的EGFP-N融合蛋白，因为EGFP蛋白的分子质量约为27ku，N蛋白的分子质量约为43ku，结果与预期相符合（图3）。

图3 N蛋白表达的Western blot检测结果Fig.3 Western blot detection results of N protein

2.4 N蛋白对细胞周期的影响

利用流式细胞仪对N蛋白表达的SIEC细胞周期进行分析见图4。结果表明，对照组SIEC的细胞周期 G0／G1期、S期和 G2／M 期的含量分别为82.55%、14.91%、2.54%；对照组细胞 SIEC-pEGFP-N1的细胞周期各期G0／G1期、S期和G2／M期的含量分别为84.01%、12.5%、3.5%；而试验组细胞pEGFP-N1-N的各细胞周期分别为G0／G1期70.02%、S期25.59%、G2／M 期4.39%。这表明TGEV N蛋白能够延长细胞周期的S期。

3 讨论

猪传染性胃肠炎在多个国家及地区出现和流行，我国从20世纪50年代起就有猪传染性胃肠炎的记载，近些年来其流行危害有进一步加剧的趋势，给我国养猪业造成了严重的经济损失［11］。TGEV属于Ⅰ类冠状病毒，主要经口和鼻感染，小肠是该病毒的靶器官。SIEC作为TGEV天然的靶细胞，能够更好地反映病毒对机体的致病作用。本试验选用SIEC表达TGEV N蛋白，为研究TGEV N蛋白的功能积累更多的理论资料。

研究表明，病毒感染宿主细胞后在特定的细胞周期进行复制，并通过编码特定的基因产物抑制细胞周期蛋白的活性，进而导致细胞周期的阻滞［12］。IBV、SARS等冠状病毒的N蛋白通过抑制细胞周期蛋白cyclin-CDK的活性影响S期细胞周期阻滞［13］。N蛋白作为TGEV重要的结构蛋白，不仅能够诱导机体产生细胞免疫，还在病毒基因组RNA的复制和转录加工过程中具有重要作用。因此，本试验利用流式细胞术分析TGEV N蛋白对细胞周期产生的影响。结果显示，试验组与对照组比较细胞周期S期含量呈上升趋势且差异显著，而细胞周期G0／G1和G2／M期变化差异不显著，表明TGEV N蛋白的表达可以延长细胞周期S期，抑制细胞通过S期进入G2／M期进而阻滞宿主细胞的生长，说明TGEV感染SIEC后调控细胞周期S期为自身生存创造有利条件。

图4 流式细胞仪分析TGEV N蛋白的表达对SIEC细胞周期的影响Fig.4 Analysis of the stages of cell cycle with the cells expressing TGEV N protein by flow cytometry

总之，本试验成功地将重组质粒在SIEC中获得初步表达，荧光倒置显微镜可观察到表达产物主要存在于转染细胞的细胞质内。流式细胞术检测N蛋白能够延长细胞周期的S期，但N蛋白通过何种机制干扰宿主细胞周期尚不清楚。因此，试验拟将对TGEV N蛋白表达后对细胞周期蛋白活性的影响进行深入研究，分析TGEV阻滞宿主细胞周期的机制。另外，从研究N蛋白对细胞周期的影响着手进一步分析N蛋白的其他功能是下一步研究的重点。

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