液相色谱-质谱法测定血清中左乙拉西坦含量

帅放文，王向峰，雷玉萍，肖江，帅海涛

(湖南省药用辅料工程技术研究中心有限公司，长沙 410331)

液相色谱-质谱法测定血清中左乙拉西坦含量

帅放文，王向峰，雷玉萍，肖江，帅海涛

(湖南省药用辅料工程技术研究中心有限公司，长沙 410331)

建立测定血清中左乙拉西坦浓度的液相色谱-质谱方法。血清样品用甲醇提取，离心分离除去蛋白，采用液相色谱-质谱法测定其中左乙拉西坦的含量。流动相为甲醇-0.1%甲酸(体积比为80∶20)，色谱柱为Agilent C18柱(100 mm×4.6 mm，3.5μm)。左乙拉西坦含量在1 000～100 000 ng/mL范围内与色谱峰面积线性关系良好，线性相关系数r2=0.999，检出限为10 ng/mL。测定结果的相对标准偏差为0.93%(n=6)，样品加标回收率为99.4%～101.3%。该方法具有较高的灵敏度、准确度和良好的精密度，适合血清中左乙拉西坦含量的测定。

液相色谱-质谱；血清；左乙拉西坦

左乙拉西坦［1-2］[levetiracetam，化学名为(S)-α-乙基-2-氧代-1-吡咯烷乙酰胺]是一种乙酰吡咯烷类化合物，结构式见图1。作为一种广谱抗癫痫药物［3-5］，左乙拉西坦具有耐受性好、高效、不良反应少、药物之间相互作用小、具有较好的药代动力学［6-8］等特点。它由比利时UCB制药公司开发，2000年4月作为新型抗癫痫药物首次在美国上市，在欧美地区已被广泛使用，具有广阔的市场前景。

图1 左乙拉西坦结构式

目前测定左乙拉西坦血药浓度的方法主要为高效液相色谱法(HPLC-UV)［9-14］，国外现行药典［15-16］收录了其质量标准，其有关物质的分析方法均采用液相色谱法，但由于其紫外最大吸收波长为末端吸收，基线波动较大，检测限较高。笔者采用分析时间短、灵敏度高的液相色谱-质谱联用方法对血药中微量的左乙拉西坦进行测定，此方法还可以为左乙拉西坦溶液和可能出现的杂质提供定性分析，为临床安全、有效、合理用药提供基础。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

液相色谱-质谱联用仪：ABI 3200 Q Trap型，美国AB Sciex公司；

左乙拉西坦标准品：纯度为100%，加拿大TRC公司；

甲醇：色谱纯；

实验所用其它试剂为分析纯；

实验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

色 谱 柱：Agilent C18柱 (100 mm×4.6 mm，3.5 μm，美国安捷伦公司)；柱温：40℃；流动相：甲醇-0.1%甲酸(体积比为80∶20)；流量：0.5 mL/min；进样体积：10 μL。

1.2.2 质谱条件

气帘气：68.95 kPa(10 psi)；离子源电压：4 500 V；离子源温度：600℃；雾化气：241.325 kPa(35 psi)；辅助气：344.75 kPa(50 psi)；去簇电压：344.75 kPa(50 psi)；入口电压：68.95 kPa(10 psi)。

1.3 实验方法

精密量取血清2 mL，加入甲醇8 mL，漩涡震荡1 min，离心5 min，取上清液10 μL进样分析。采用外标法，以峰面积定量。

1.4 左乙拉西坦标准储备溶液的配制

精密称取左乙拉西坦标准品10 mg，置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释至标线，制得0.1 mg/mL的左乙拉西坦标准储备溶液，置冰箱中于4℃保存备用。

2 结果与讨论

2.1 分析条件的选择

2.1.1 流动相的优化

分别以甲醇-水和甲醇-0.1%甲酸水溶液作为流动相进行考察。甲醇-水作为流动相时，峰型出现拖尾，故加入一定量的甲酸，抑制其拖尾。因此选择甲醇-0.1%甲酸水溶液作为流动相。此外还考察了流动相比例、流速、柱温条件，发现这些因素对色谱峰分离及峰形无明显影响，为缩短分析时间，最终选择流动相比例为80∶20，流速为0.5 mL/min，柱温为40℃。

2.1.2 离子化模式选择

左乙拉西坦带有—NH2基团，故正离子模式响应强于负离子模式。分别考察正负离子模式对左乙拉西坦质谱响应的影响，结果表明左乙拉西坦在负离子模式下响应较低，不适合用于分析，因此选择正离子模式检测。

2.2 定性分析

在ESI正离子源下，对样品进行全扫描，利用特征碎片离子对化合物进行定性，质谱图见图2。由图2可知，基峰m/z=193.2为该化合物与1个钠离子结合得到的[M+Na]+离子峰；m/z=126.2，为该化合物丢失酰胺碎片得到的[M—(—C=O—NH2)]+离子峰。故可知该化合物的相对分子质量为170.2，与左乙拉西坦的相对分子质量一致。

图2 左乙拉西坦质谱图

2.3 系统适用性试验

将无药血清作为空白血清，对空白血清与加入标准品溶液的血清分别进样测定，空白血清及其加标色谱图分别见图3、图4。由图3、图4可知，血清内源性成分不干扰左乙拉西坦的测定

图3 空白血清色谱图

图4 加标血清样品色谱图

2.4 稳定性试验

在空白血清中，分别加入左乙拉西坦标准溶液，配制成10，30，50 μg/mL的血清样品，将其置冰箱中于-30℃保存，隔1天取出，置于室温条件下解冻，当其完全融化后，再放入冰箱中于-30℃保存，反复冻融3次，每次融化后对样品进行测定，结果见表1。

表1 加标血清样品测定结果

由表1可知，冻融3次前后，血清中左乙拉西坦含量无明显变化，说明该样品稳定性较好。

2.5 标准曲线及检测限

配制血清中左乙拉西坦质量浓度分别为1 000，5 000，10 000，50 000，100 000 ng/mL的系列标准工作溶液，分别进样10 μL，测定其色谱峰面积，对标准工作溶液质量浓度(x)与色谱峰面积(y)进行线性回归，得线性方程为y=12 483x-3×107，线性相关系数r²=0.999，左乙拉西坦的质量浓度在1 000～100 000 ng/mL范围内具有良好的线性关系。以信噪比为3考察该药物的检出限，得血清中左乙拉西坦检出限为10 ng/L。

2.6 精密度试验

配制血药浓度为10 μg/mL的左乙拉西坦标准样品，精密量取10 μL进样，连续进样6次，测定其色谱峰面积，结果见表2。由表2可知，该方法精密度良好，能满足左乙拉西坦的含量测定。

表2 精密度试验结果

2.7 回收试验

将1.3配制的血清样品取1 mL，分别置于3只2 mL容量瓶中，再分别加入0.12，0.2，0.28 mL左乙拉西坦标准溶液，用甲醇稀释至标线，摇匀，配制成含高、中、低浓度各3份的样品溶液。按实验方法测定，回收试验结果见表3。由表3可知，该方法具有较高的准确度。

表3 回收试验结果

3 结语

采用液相色谱-质谱法对血清中的左乙拉西坦进行定性定量测定。通过方法学验证，该方法具有简便快速、灵敏度高等特点，为血清中的左乙拉西坦含量监测提供了新的分析手段。同比《美国药典》和《欧洲药典》的液相色谱法，本方法具有分析时间短(2.1 min)，检出限(10 ng/mL)低等特点，可用于临床血清中左乙拉西坦含量的监测。

［1］ 田国红，赵忠新.左乙拉西坦—一种具有全新作用机制的抗癫痫新药［J］.中国新药与临床杂志，2006，25(10): 782-785.

［2］ 陈仁海，黄晓玲，邓轶方，等.左乙拉西坦缓释片在Beagle犬中的生物等效性研究［J］.药学实践杂志，2015，33(1): 32-35.

［3］ 丁庆明，任连坤.抗癫痫新药左乙拉西坦的临床应用和安全性［J］.药物不良反应杂质，2007，9(4): 295-301.

［4］ Zhou Junying，Tang Xiangdong，Huang Lili，et al. The acute effects of levetiracetam on nocturnal sleep and daytime sleepiness in patients with partial epilepsy［J］. J Clin Neurosci，2012，19(7): 956-960.

［5］ Armel S，Sarah L，Fransoise T. Clinical pharmacology of levetiracetam for the treatment of epilepsy［J］. Expert Rev Pharmacol，2009，2(4): 339-350.

［6］ 张轶群，李吉，胡玉，等.抗癫痫药物左乙拉西坦［J］.中国神经免疫学和神经病学杂志，2010，17(2): 145-147.

［7］ 施安国，费艳秋，王平全.抗癫痫新药左乙拉西坦［J］.中国新药杂志，2000，9(11): 742-744.

［8］ 付凯，赵努恩吉雅.左乙拉西坦对部分性癫痫患者脑电及生活质量的影响［J］. 中国实用医药，2015，10(14): 176-177.

［9］ 王颖慧，魏敏吉，王云秀，等.高效液相色谱法测定左乙拉西坦血药浓度［J］.儿科药学杂志，2010，16(4): 34-36.

［10］ 李惠芬，张玉琴，刘彦. HPLC法测定人血清左乙拉西坦的浓度［J］.临床药学，2013，24(14): 1 272-1 274.

［11］ 黄雪涛.高效液相色谱法对左乙拉西坦浓度的测定及药动学研究［J］.内蒙古中医药，2013，18: 144-145.

［12］ 王刚，张君梅，易晓燕，等.高效液相色谱法测定癫痫患儿血清中左乙拉西坦的浓度［J］.中国新药与临床杂志，2011，30(6): 476-480.

［13］ 石璐燕，于燕燕，吴范宏. HPLC法测定左乙拉西坦含量及其有关物质［J］.化学试剂，2013，35(4): 337-340.

［14］ 张娇娇，宋艳霞，李直，等.左乙拉西坦中有关物质检查方法的比较研究［J］.华西药学杂志，2015，30(1): 91-100.

［15］ US Pharmacopeia Convention. USP 36/NF31［ M］. Baltimore, M D: United Book Press, 2013: 4 084-4 086.

［16］ Council of Europe. EP8.0［ M］. Beck Nordlingen: Druckerei C H, 2013: 2 352-2 353.

2015全国化学分析计量技术研讨会于青岛召开

2015年8月26-28日，“2015全国化学分析计量技术研讨会”在山东青岛市召开。本次会议由中国仪器仪表学会分析仪器分会、国防科技工业应用化学一级计量站、兵器工业非金属材料理化检测中心联合主办，《化学分析计量》杂志社承办。中国仪器仪表学会分析仪器分会理事长关亚风出席会议，10余位专家学者进行了大会报告，参会代表对大会报告反应热烈。

（化学分析计量杂志社）

Determination of Levetiracetam in Serum by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Shuai Fangwen, Wang Xiangfeng, Lei Yuping, Xiao Jiang, Shuai Haitao
(Excipients Hunan Provincial Engineering Technology Research Center Limited Company, Changsha 410331, China)

A method of liquid chromatography-mass spectrometry for determination of levetiracetam concentrations in serum was established. The sample was deproteinized with methanol, and then levetiracetam concentrations in serum was determined by liquid chromatography-mass spectrometry with Agilent C18column(100 mm×4.6 mm，3.5μm) and mobile phase consisted of methanol-0.1% formic acid(volume ratio was 80∶20). The content of levetiracetam had good linear relationship with the chromatographic peak area in the range of 1 000-100 000 ng/mL，and the linear correlation coefficientr2=0.999. The detection limit was 10 ng/mL. The relative standard deviation of determination results was 0.93%(n=6), and the recoveries of standard addition were 99.4%-101.3%. This method was suitable for detecting levetiracetam in serum with advantages of good precise，high accuracy and sensitivity.

liquid chromatography-mass spectrometry; serum; levetiracetam

O657.7

：A

：1008-6145(2015)05-0072-03

10.3969/j.issn.1008-6145.2015.05.019

联系人：帅海涛；E-mail: 617215816@qq.com

2015-05-03