基于超高压液相色谱串联质谱的致癌芳香胺同分异构体快速鉴别

王 倩，卢 鸯

(浙江省纺织测试研究院，杭州 310018)

基于超高压液相色谱串联质谱的致癌芳香胺同分异构体快速鉴别

王 倩，卢 鸯

(浙江省纺织测试研究院，杭州 310018)

采用超高压液相色谱串联质谱仪，对几种在常规气质条件下不能分离的致癌芳香胺异构体进行快速鉴别实验。实验优化了质谱条件和色谱参数。结果表明：在优化后的实验条件下，依据所研究的5种致癌芳香胺与其异构体在保留时间上的差异，可以对异构体进行鉴别；与常压液相色谱法相比，分析时间大为缩短，准确性更高。

超高压液相色谱串联质谱；致癌芳香胺；禁用偶氮染料；同分异构体；定性

在日常的禁用偶氮染料检测中，某些芳香胺同分异构体的存在常常成为检测中的一个困扰。因芳香胺异构体与禁用的芳香胺结构相似，物化性质相近，色谱保留行为或质谱信息区别不大，采用单一气相色谱或液相色谱分析时，不被禁用的芳香胺异构体容易被当作禁用的芳香胺检出，影响定性或定量结果的准确性。因此，近年来有不少鉴别致癌芳香胺同分异构体的研究报道，尝试通过采用不同极性的气相色谱柱[1-3]、气质联用与液相色谱相结合[4-6]以及对芳香胺进行衍生化处理[7]等方法，实现某些致癌芳香胺与其同分异构体的有效分离。

超高压液相色谱(UHPLC-MS/MS)由于采用亚2μm粒径填料的色谱柱，通常可得到比常规液相色谱更快的分离速度和更高的灵敏度[8]，近年来在环境、食品、药品等检测领域得到了广泛应用。本研究采用超高压液相色谱串联质谱仪，对采用弱极性气相色谱条件下难以分离的5种芳香胺及其异构体的分离条件进行了试验，建立了比常压液相色谱更快速准确的芳香胺同分异构体鉴别方法。

1 试 验

1.1 实验材料与仪器

实验材料：邻甲苯胺、对甲苯胺、对氯苯胺、间氯苯胺、4-氯邻甲苯胺、4-氯间甲苯胺、5-氯邻甲苯胺、2,4-二氨基甲苯、2,6-二氨基甲苯、2,4-二氨基苯甲醚、3,4-二氨基苯甲醚标准物质(纯度>97%，德国Dr.Ehrenstorfer GmbH)；甲醇(HPLC级，美国TEDIA公司)；乙酸铵、乙酸(HPLC级，美国ROE SCIENTIFIC INC.)；实验用水为超纯水。

实验仪器：Ultimate3000-TSQ Quantum ULTRA液相色谱-三重四极杆串联质谱仪(美国Thermo Fisher公司)。

1.2 标准溶液的配制

分别称取适量的芳香胺及其异构体标准物质，以色谱纯甲醇为溶剂，超声使充分溶解，配制成1000mg/L的储备液，再稀释成20mg/L的标准工作液备用。

1.3 色谱、质谱分析条件

色谱条件：Hypersil Gold色谱柱(100mm×2.1mm，1.9μm)；流动相：25%甲醇-75%乙酸铵溶液(10mmol/L，pH=4.0)；进样量：2.0μL；流速：0.2mL/min；柱温：35℃。

质谱条件：电喷雾正离子模式(ESI+)；毛细管温度：350℃；蒸发温度：350℃；鞘气流速：35mL/min；辅助气流速：10mL/min；毛细管电压：3000V；采用多反应监测(multiple reaction monitoring, MRM)模式；其他参数见表1。

2 结果与讨论

相关研究[5]已经得出，当仅采用常规的弱极性色谱柱(如DB-5MS)进行气质法分析时，4-氯邻甲苯胺、对氯苯胺、2,4-二氨基苯甲醚、邻甲苯胺、2,4-二氨基甲苯均存在保留时间相同或相近的同分异构体，不能有效分离。因此，本实验的研究对象是这5种芳香胺及其在气质法中不能有效分离的异构体。实验以各种芳香胺及其同分异构体的标准品为依据，通过同一色质谱分析条件下获得的保留时间、质谱特征离子信息进行定性鉴别。

2.1 质谱条件的优化

质谱条件的优化仅针对禁用的5种芳香胺进行，若其同分异构体在同等条件下不能生成相同的母离子和/或子离子，不能出峰，则可直接根据这一特点进行鉴别。根据芳香胺的特点，采用电喷雾正离子(ESI+)模式，在MRM检测方式下对碰撞能量、套管透镜补偿电压等质谱测定条件进行优化，使目标化合物的分子离子对信号达到最佳。一般质谱定性确证分析需要4个识别点，因此，本实验中每个化合物选择2对分子离子对。建立的MRM分析方法条件见表1。

表1 5种禁用芳香胺及其异构体的MRM分析参数

2.2 色谱条件的优化

采用Hypersil Gold C18柱，以甲醇和10mmol/L乙酸铵(pH=4.0)为流动相，分别试验了甲醇体积比在20%～40%范围内各芳香胺与其异构体的分离情况。根据2.1所确定的质谱条件，各芳香胺的异构体均能出峰，且所得到的质谱信息不足以区分不同结构的异构体。从表2数据可以看出，当流动相中甲醇含量小于等于25%时，所研究的5种芳香胺与其异构体在保留时间上出现差异，分离度>0.5，能够进行定性鉴别。甲醇含量越低，分离越完全，但分析时间也随之延长。因此，确定流动相比例为：25%甲醇∶75%乙酸铵溶液。当需要对禁用芳香胺与其异构体进行定量分析时，可根据情况进一步优化实验条件。

在确定流动相比例为25%甲醇∶75%乙酸铵溶液的基础上，分别试验了乙酸铵pH值为6.9、5.5、4.0时，各种芳香胺的分离情况。结果表明，乙酸钠pH值从4.0到6.9，芳香胺的保留时间变化不大。因此，本实验选择调节乙酸铵pH为4.0。

在优化后的色谱条件下，各组芳香胺与其异构体的色谱图见图1。

表2 不同流动相比例下5种芳香胺与其异构体的保留时间(tR)和分离度(R)变化情况

图1 各组芳香胺与其异构体的色谱分离图

2.3 与普通液相色谱方法的比较

通过对比在普通高效液相色谱上的结果如表3所示。从表3可以看出，采用超高压液相色谱，在得到同样良好的分离情况下，分析时间缩短了将近一半，更快速简便。此外，由于串联质谱具有母离子和子离子一一对应的多反应监测模式可以有效地去除基体杂质干扰，在实际样品分析中选择性更高。

表3 本方法与常压液相色谱下5种芳香胺与其异构体的保留时间对比

3 结 论

超高压液相色谱串联质谱具有分析速度快、灵敏度高、能有效去除基体杂质干扰等优点。本文利用UHPLC-MS/MS对5种在常规气质条件下不能分离的致癌芳香胺异构体建立了鉴别方法，在优化后的色质谱条件下，依据保留时间即能完全区分禁用与非禁用芳香胺。与常规液相鉴别方法相比，本文提出的方法时间缩短近一半，可用于日常对GC-MS法检测的阳性样品的快速鉴别确证。

[1] 赵 嵩,张 菁.禁用芳香胺及其同分异构体的分离研究[J].上海丝绸,2010(1):7-17.

[2] 崔庆华,杨晓勇,田金家.邻氨基苯甲醚同分异构体的分离[J].纺织导报,2010，31(3):106.

[3] 韩 军,杨 萌,白子竹,等.致癌芳香胺同分异构体鉴别方法研究[J].中国纤检,2014(2):73-75.

[4] 胡小钟,余建新,倪澜荪,等.禁用偶氮染料检测中假阳性结果的鉴别方法[J].分析化学,2000,28(4):411-416.

[5] 卢 鸯,叶琳虹,韩高锋.提高禁用偶氮染料检测准确性探讨[J].中国纤检,2011(5):56-58.

[6] 张建扬.禁用偶氮染料检测中相似物质的判定[J].纺织标准与质量,2005(5):49-51.

[7] 海 勇.致癌芳香胺的检测[J].印染助剂,2005,22(9):42-45.

[8] 刘 颖,周建良,李 萍.快速高效液相色谱分离技术在中药分析中的应用[J].色谱,2009,27(5):682-689

(责任编辑：康 锋)

Rapid Identification of Isomers of Cancerogenic Aromatic Amines Based on Ultra-high Pressure Liquid Chromatography Tandem Mass Sperctrometry

WANGQian,LUYang

(Zhejiang Textile Testing Research Institute, Hangzhou 310018, China)

Rapid identification of isomers of cancerogenic aromatic amines which could not be separated under conventional conditions was carried out with ultra-high pressure liquid chromatography tandem mass spectrometry. The parameters of mass spectrometry and liquid chromatography parameters were optimized in this experiment. The experimental results show that under optimized experimental conditions, isomers can be identified according to differences of 5 cancerogenic aromatic amines and their isomers in retention time. Compared with normal pressure liquid chromatography, the analysis time shortens greatly and the accuracy is higher.

UHPLC-MS/MS; cancerogenic aromatic amines; banned azo dyes; isomer; identification

2014-11-21

王 倩(1986-)，女，浙江东阳人，助理工程师，主要从事纺织品检测技术方面的研究。

卢 鸯，E-mail:zjttjly@outlook.com

O658;O657

A

1009-265X(2015)03-0062-03