APP下载

虎杖白藜芦醇对人肝癌HepG-2细胞株增殖和生长周期的影响*

2015-06-15顾生玖李美波许有瑞朱开梅

医药导报 2015年2期
关键词:虎杖细胞株白藜芦醇

顾生玖,李美波,许有瑞,朱开梅

(桂林医学院药学院,桂林 541004)

虎杖白藜芦醇对人肝癌HepG-2细胞株增殖和生长周期的影响*

顾生玖,李美波,许有瑞,朱开梅

(桂林医学院药学院,桂林 541004)

目的 探讨虎杖中白藜芦醇对人肝癌HepG-2细胞株增殖和生长周期的影响。方法 采用微波辅助法提取虎杖中白藜芦醇,将12.5,25.0,50.0,100.0 μmol·L-1白藜芦醇作用人肝癌HepG-2细胞,采用噻唑蓝(MTT)法检测虎杖中白藜芦醇对肝癌细胞HepG-2细胞抑制增殖作用,在倒置相差显微镜下观察细胞形态变化,流式细胞术(FCM)检测细胞周期的分布。结果 虎杖中白藜芦醇能显著抑制HepG-2细胞的生长,并呈现时间-浓度依赖性。流式细胞仪结果显示,白藜芦醇作用于细胞HepG-2且细胞被阻滞于S期,呈现出剂量依赖性。不同药物浓度白藜芦醇(12.5,25.0,50.0,100.0 μmol·L-1)作用人肝癌HepG-2细胞株48 h后,随着药物浓度的增大,G0/G1期的比例逐渐减小,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。而实验组细胞S期的比例随着浓度增大而增加,分别达到(44.82±1.21)%,(54.00±1.71)%,(65.21±3.66)%,(77.50±4.21)%,与对照组(34.75±3.92)%比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 虎杖中白藜芦醇能明显抑制肝癌HepG-2细胞的增殖,并诱导其细胞凋亡,可引起肝癌HepG-2细胞的S期阻滞。

虎杖;白藜芦醇;HepG-2细胞;细胞周期

虎杖是临床常用中药材,为蓼科蓼属多年生草本植物虎杖PolygonumCuspidatumSieb.et Zucc 的干燥根茎和根。我国大部分地区均产,主产于江苏、江西、山东、四川等地。别名阴阳莲、苦杖、酸杖、斑杖、土大黄、大叶蛇总管等,入药始见于《雷公炮炙论》[1]。虎杖中主要含蒽醌类、二苯乙烯类、黄酮类、鞣质等多酚性化合物[2-3],以白藜芦醇含量最高。白藜芦醇(resveratrol)是一种天然的蒽醌萜类化合物。最近研究表明,白藜芦醇具有较强的抗肿瘤、抗炎、调节免疫功能及保护心血管等作用[4-5],并在癌前病变肿瘤的起始及演变阶段均有抑制作用,具有良好的癌症预防及治疗前景[6],是一种极具开发价值的天然物质,被喻为继紫杉醇之后的又一新的绿色抗癌物质。肝癌是一种常见的恶性肿瘤,严重危害人们的健康和生命。笔者拟在前期实验的基础上,选择虎杖白藜芦醇和肝癌HepG-2细胞为研究对象,通过体外实验观察虎杖白藜芦醇对肝癌细胞增殖和周期的影响,初步探讨虎杖白藜芦醇用于肝癌治疗的可能性。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 虎杖,于2011年11月采集于桂林医学院药用植物园,由药学院天然药化教研室付鹏博士鉴定为蓼科植物虎杖(PolygonumcuspidatumSieb.et Zucc.)的根茎及根,将样品阴干,粉碎过内径(150.0±6.6) μm(100目)筛,备用;白藜芦醇标准品(上海哈灵生物科技有限公司,含量:99.9%,批号:111535-200502);虎杖中白藜芦醇由本实验室提取,溶解于二甲亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)备用;噻唑蓝(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT,美国Amresco公司,批号:0782);DMSO(美国Amresco公司,批号:3557A37);1640培养基(RPMI-1640,美国Gibco公司,批号:1403233);胎牛血清(FBS,浙江天杭生物科技有限公司,批号:100421);碘化丙啶(propidium iodide,PI,美国Amresco公司,批号:0975);实验中其余试剂均为分析纯。

1.2 细胞株及培养 人肝癌细胞株HepG-2由桂林医学院科学实验中心惠赠。人肝癌HepG-2细胞用含10%FBS、100 U·mL-1青霉素、100 U·mL-1链霉素的RPMI1640培养液,在37 ℃、5%二氧化碳(CO2)的培养箱中培养。待细胞融合状态达80%~90%时用胰酶消化后传代,取对数生长期细胞进行实验。

1.3 仪器 旋转蒸发仪(德国,Laborota 4000 efficient);210型高效色谱仪(美国VARIAN公司);NJL07-3型微波炉(南京杰全微波设备有限公司);DG3002型酶联免疫检测仪(国营华东电子管厂);FACSCantoⅡ流式细胞仪(美国BD公司);DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限责任公司);XF-20旋风医药粉碎机(黄骤市振兴机电仪器厂);Axiover-40倒置相差显微镜(德国蔡司公司);CO2培养箱(美国Thermo公司)。

1.4 虎杖白藜芦醇的提取 准确称取干燥的虎杖粉末10 g,加入20倍70%乙醇溶液浸泡4 h,在微波功率100 W,25 ℃条件下萃取10 min后,稍冷,过滤。收集滤液,经旋转蒸发仪蒸发乙醇至浓缩液无醇味。将乙醇浓缩液用乙酸乙酯萃取,取乙酸乙酯层,在40 ℃下减压蒸馏至干,最后得到白藜芦醇(纯度:94.62%)。

1.5 色谱条件 色谱柱为Eclipse XDB-C8柱(150 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为甲醇-水(35:65),流速1.0 mL·min-1,柱温25 ℃,检测波长303 nm,进样量10 μL。

1.6 溶液的制备

1.6.1 对照品溶液的制备 精密称取白藜芦醇标准品5 mg,用甲醇溶解并定容于50 mL量瓶中,得到100 mg·L-1的白藜芦醇标准储备液。

1.6.2 供试品溶液的制备 精密称取白藜芦醇提取物5 mg,用甲醇溶解并定容到10 mL量瓶,经内径0.45 μm微孔膜滤过。

1.7 线性关系考察 精密吸取对照品溶液0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mL,加入10 mL量瓶,加甲醇至10 mL量瓶,定容,得到2,4,6,8,10 mg·L-1的白藜芦醇标准储备液。按“1.5”项下色谱条件进行检测,以峰面积(Y)为纵坐标,进样浓度(X)为横坐标,绘制标准曲线,得回归方程Y=57.45X-0.000 01(r=0.999 3)。白藜芦醇标准品在浓度0.001~0.012 g·L-1范围内,线性关系良好。

1.8 加样回收率考察 准确称取同一批虎杖样品5份,每份各10 g,分别精密加入一定量对照品溶液,按照“1.6”的方法得到待测液,按“1.5”项下色谱条件进样测定,白藜芦醇平均回收率为98.99%,RSD=0.99%。

1.9 MTT法测定虎杖中白藜芦醇对人肝癌HepG-2细胞株增殖的抑制率 取对数生长期的细胞,将人肝癌HepG-2细胞株浓度调整为2×104个·mL-1,按每孔100 μL接种于96孔板,每组设复孔5个。置于37 ℃,5%CO2饱和湿度的培养箱中培养,待细胞完全贴壁后,吸除培养液,分别加入不同浓度白藜芦醇使其终浓度为12.5,25.0,50.0及100.0 μmol·L-1,并同时设阴性对照组(不加药),分别培养24,48和72 h后,每孔加入5 mg·mL-1MTT溶液20 μL终止培养,于37℃孵育4 h,吸取上清液,每孔再加入DMSO150 μL,轻微振荡,用酶联免疫检测仪测定波长490 nm处吸光度(A)值,并计算细胞抑制率。重复测量3次,取其平均值。抑制率(%)=(对照组A490-实验组A490)/对照组A490×100%。

1.10 倒置相差显微镜下观察白藜芦醇对人肝癌HepG-2细胞株形态的影响 收集对数生长期肝癌HepG-2细胞,以每孔2×105个细胞的密度接种于6孔培养板,待细胞完全贴壁后,吸除培养液,分别加入不同浓度的白藜芦醇,使其终浓度为12.5,25.0,50.0及100.0 μmol·L-1,并同时设阴性对照组(不加药)。继续培养48 h后去掉培养液,倒置相差显微镜下观察细胞形态并摄像。

1.11 流式细胞术(flow cytometry,FCM)PI单标法检测细胞周期 按“1.2”项下方法培养细胞48 h后,1 000 r·min-1离心10 min,离心半径17.2 cm,弃上清液,再加入磷酸盐缓冲液(phosphate buffered salution,PBS)5 mL,再次离心,弃上清液,用预冷的PBS 1 mL重悬细胞,加入70%冰乙醇(-20 ℃)固定24 h。检测前2 000 r·min-1,离心半径17.2 cm,离心5 min去乙醇。用PBS洗涤2次,加入含有终浓度为50.0 μg·mL-1PI和100.0 μg·mL-1RNase A,4 ℃避光染色1 h,用流式细胞仪进行检测。

2 结果

2.1 对人肝癌HepG-2细胞株增殖的影响 虎杖中白藜芦醇对肝癌HepG-2细胞增殖的影响结果见图1。虎杖中白藜芦醇对肝癌HepG-2细胞的增殖有抑制作用,且随着药物浓度的升高或时间延长,抑制率逐渐增加。当白藜芦醇浓度达到50.0,100.0 μmol·L-1时,其对HepG-2细胞增殖抑制作用明显增强,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。100.0 μmol·L-1白藜芦醇作用于HepG-2细胞48和72 h,对细胞抑制率分别达48.73%,58.75%。

2.2 HepG-2细胞形态学变化 经不同浓度白藜芦醇孵育HepG-2细胞24 h后,倒置相差显微镜下观察形态变化,结果见图2。结果显示:未添加白藜芦醇的阴性对照组,HepG-2细胞贴壁生长良好,细胞排列紧密、边界清楚,细胞饱满呈现多边形或梭形,细胞密度大。白藜芦醇12.5 μmol·L-1组细胞形态学变化与对照组相比,变化不明显。其余组细胞贴壁数量均有不同程度的减少,细胞排列紊乱,50.0和100.0 μmol·L-1组细胞生长状态明显较阴性对照组差,细胞皱缩,贴壁不佳,细胞间隙变大,脱落明显增多,胞液中有漂浮的细胞。

图1 白藜芦醇对肝癌HepG-2细胞增殖的影响

Fig.1 Effect of Resveratrol on the growth of HepG-2 cells

2.3 虎杖中白藜芦醇对HepG-2细胞的细胞周期影响及结果分析 HepG-2细胞经不同浓度白藜芦醇作用48 h后,FCM检测细胞周期分布,结果见图3和表1。根据统计结果显示:随着药物作用浓度增大,G0/G1期细胞的比例逐渐减小,与对照组比较差异有统计意义(P<0.05);实验组细胞S期的比例随着浓度增大而增加,与阴性对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05),其中50.0 μmol·L-1,100.0 μmol·L-1组与阴性对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。各浓度组间比较,随着药物浓度增高,S期细胞比例逐渐增加,表现出一定的浓度依赖性。不同浓度细胞G2/M期比例有差异,与阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。对细胞周期结果分析显示,白藜芦醇可影响HepG-2细胞周期的分布,将HepG-2细胞阻滞在S期。

A.阴性对照组;B.25.0 μmol·L-1白藜芦醇组;C.50.0 μmol·L-1白藜芦醇组;D.100.0 μmol·L-1白藜芦醇组

A.阴性对照组;B.12.5 μmol·L-1白藜芦醇组;C.25.0 μmol·L-1白藜芦醇组;D.50.0 μmol·L-1白藜芦醇组;E.100.0 μmol·L-1白藜芦醇组

图3 不同浓度白藜芦醇作用肝癌HepG-2细胞48 h后细胞周期分布

A.negative control group;B.12.5 μmol·L-1resveratrol group;C.25.0 μmol·L-1resveratrol group;D.50.0 μmol·L-1resveratrol group; 100.0 μmol·L-1resveratrol group

Fig.3 Cell cycle distribution of HepG-2 cells after 48 h treatment by different concentration of resveratrol

表1 5组HepG-2细胞经作用48 h后不同周期细胞所占比例测定结果

与阴性对照组比较,*1P<0.05,*2P<0.01

Compared with negative control group,*1P<0.05,*2P<0.01

3 讨论

原发性肝癌是常见恶性肿瘤之一,我国是肝癌高发区,发病率占世界肝癌总数的43.7%,南方地区发病率更高[7]。原发性肝癌具有早期诊断困难,发现时多为中晚期,已失去手术机会,常规放、化疗药物作用局限,预后差等特点。中药可以弥补手术治疗、放射治疗、化学治疗的不足,既能巩固放疗化疗的效果,又能消除放、化疗的毒副作用,更重要的是可以切断癌细胞的复制功能[8]。因此,寻找毒副作用小,效果明显的抗癌药物就成为了研究重点。最近研究显示,白藜芦醇能抑制多种体外培养的肿瘤细胞系的增殖如宫颈癌、肾细胞癌[9-10]等。本实验结果显示虎杖中白藜芦醇能抑制肝癌HepG-2细胞株的增殖,且对肝癌细胞的抑制作用有时间和剂量依赖性,随着作用时间延长和作用浓度增加,抑制作用明显增强,提示可直接作用于肿瘤细胞,抑制肿瘤细胞生长。当药物浓度达到100.0 μmol·L-1时,作用72 h后对肝癌HepG-2细胞株的抑制率可达到58.75%,显示出较强的抗肿瘤活性。有学者进行DNA微阵列分析乳腺癌细胞株MCF-7,研究白藜芦醇的抗肿瘤可能机制,但具体作用机制仍需深入探讨[11]。

有研究报道,白藜芦醇抑制肿瘤细胞的增殖主要表现在抑制肿瘤细胞DNA的合成[12-13],或针对细胞周期G1→S和S→G2期,通过对细胞周期素的影响,上调或减少细胞周期依赖激酶等,从而使细胞周期发生阻滞。笔者在本研究中也发现虎杖中白藜芦醇作用于肝癌HepG-2细胞48 h后,可抑制癌细胞从S期进入G2/M期,使G0/G1比例显著减少,S期比例显著增多,将细胞阻滞于S期,通过抑制DNA的合成,从而抑制癌细胞的生长,并存在剂量依赖关系。

[1] 樊慧婷,丁世兰,林洪生.中药虎杖的药理研究进展[J].中国中药杂志,2013,38(15):2545-2548.

[2] 李菁雯,陈祥龙,孟祥智.虎杖及其提取物的研究进展[J].中医药学报,2011,39(3):103.

[3] 刘芝兰,曾春娇,关梅春,等.白藜芦醇与白皮杉醇及赤松素研究进展[J].医药导报,2013,32(8):1043-1049.

[4] ROCCARO A M,LELEU X,SACCO A,et al.Resveratrol exerts antiproliferative activity and induces apoptosis in Waldenström's macroglobulinemia[J].Clin Cancer Res,2008,14(6):1849-1858.

[5] 梁力,李晰,王庆伟,等.小鼠血浆中白藜芦醇含量测定及药动学研究[J].医药导报,2012,31(7):846-847.

[6] 刘小丽,张伟,符毅文.虎杖中白藜芦醇的超声提取及其氧化性研究[J].中成药,2011,33(1):150-153.

[7] KOPPELMANS V, DE GROOT M D,DE RUITER M B,et al.Global and focal white matter integrity in breast cancer survivors 20 years after adjuvant chemotherapy[J].Hum Brain Mapp,2014,35(3):889-899.

[8] 陈丹丹,刘媛,姬旭慧.原发性肝癌发病影响因素的病例对照研究[J].郑州大学学报(医学版),2013,48(2):249-253.

[9] 周学武,陈建荣,刘桂艳,等.白藜芦醇对人宫颈癌Hela细胞凋亡、增殖影响的实验研究[J].齐齐哈尔医学院学报,2008,29(20):2457-2459.

[10] 单中杰,魏金星,韩前河,等.白藜芦醇对人肾细胞癌786-0细胞PDCD5表达的影响[J].中国实验诊断学,2012,16(5):785-788.

[11] LEON-GALICIA I,DIAZ-CHAVEZ J,GARCIA-VILLA E,Resveratrol induces downregulation of DNA repair genes in MCF-7 human breast cancer cells.[J].Eur J Cancer Prev,2013,22(1):11-20.

[12] PRABHU V,SRIVASTAVA P,YADAV N,et al.Resve-ratrol depletes mitochondrial DNA and inhibition of autophagy enhances resveratrol-induced caspase activation[J].Mitochondrion,2013,13(5): 493-499.

[13] LOU X D,WANG H D,XIA S J,et al.Effects of resveratrol on the expression and DNA methylation of cytokine genes in diabetic rat aortas[J].Arch Immunol Ther Exp (Warsz),2014,62(4):329-340.

Effects of Resveratrol fromPolygonumCuspidatumon Proliferation and Cell Cycle of HepG-2 Cells

GU Shengjiu, LI Meibo, XU Yourui, ZHU Kaimei

(CollegeofPharmacy,GuilinMedicalUniversity,Guilin541004,China)

Objective To investigate effects of resveratrol on the growth and cell cycle of human hepatoblastoma-derived HepG-2 cell line. Methods Resveratrol was extracted by microwave-assisted method and HepG-2 cells were exposed to resveratrol at different concentrations (12.5, 25.0, 50.0, 100.0 μmol·L-1).The viability of HepG-2 cells was measured by MTT.Morphologic changes of the cells were observed under the phase contrast microcope.The cell cycle of HepG-2 cells treated with resveratrol was analyzed by flow cytometry. Results Resveratrol could significantly inhibit proliferation of HepG-2 cells and increase the cells in the S phase in a dose-dependent manner.After 48 h treatment with different concentrations of resveratrol (12.5, 25.0, 50.0 and 100.0 μmol·L-1), the cell proportion of G0/G1phase decreased as compared with control group (P<0.05).The cell proportion of S phase increased in a dose-dependent manner, ranging from (44.82±1.21)%, (54.00±1.71)%, (65.21±3.66)% and (77.50±4.21)%, respectively, in the treatment groups as compared with negative control group[(34.75±3.92)%] (P<0.05). Conclusion Resveratrol can inhibit the proliferation of HepG-2 cells in vitro by inducing cell blockage at S phase.

PolygonumCuspidatum; Resveratrol; HepG-2 cell line; Cell cycle

2014-01-17

2014-07-07

*广西科技攻关项目(桂科合14123001-22,桂科能129825-21);广西教育厅科技项目(201202ZD065,2013YB154,2013lX080);桂林市科技攻关项目(20140122-5,20140105-5,20140105-6,20130103-8,20130103-9,20130113-1,2013lX080)。

顾生玖(1965-),男,甘肃靖远人,教授,博士,主要从事心血管病理及药物防治研究。电话:(0)13607733816,E-mail:gushengjiu@163.com。

朱开梅(1967-),女,广西桂林人,教授,硕士,主要从事化学致病分子机制和药物防治研究。电话:(0)18978345717,E-mail:glzkm@163.com。

R965

A

1004-0781(2015)02-0162-05

猜你喜欢

虎杖细胞株白藜芦醇
花生品种不同营养器官白藜芦醇含量分析
白藜芦醇改善高糖引起肾小球系膜细胞损伤的作用研究
槲芪癥消汤对人肝癌细胞株HepG2.2.15增殖和凋亡的影响
治淋浊试试虎杖
植物界的“小强”
ARHI基因对胃癌细胞株MKN28增殖、侵袭、凋亡的影响及其机制研究
虎杖验方精选
白藜芦醇,到底是何方神圣?
慢病毒载体法建立乳腺癌GFP-ST3稳定细胞株
杖责的板子该打谁?