“小绿萼”梅离体快繁体系的建立

杨丽青+杨洁+毛庆山+包满珠+张俊卫

摘要：以梅花品种小绿萼1年生枝条为试验材料，研究了采样时间、初代培养基、基本培养基和激素组合等对带芽茎段离体繁殖的影响。结果表明：（1）最佳采样时间为4—6月;（2）最佳腋芽诱导培养基为1/2 MS+1.0 mg/L 6-BA+05 mg/L KT+0.1 mg/L NAA;（3）最佳增殖培养基QL+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA，增殖系数为427;（4）无菌苗在200 mg/L IBA浸渍处理数秒后，移植到1/2 QL培养基中，生根率为80%。

关键词：梅花;离体快繁;茎段;培养基

中图分类号： S685.170.4+3 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）04-0062-03

收稿日期：2014-05-09

基金项目：国家自然科学基金（编号：31070624）;国家“863”计划（编号：2011AA100207）。

作者简介：杨丽青（1986—），女，山西朔州人，硕士，从事园林植物遗传育种研究。E-mail：1270063665@qq.com。

通信作者：张俊卫，博士，副教授，从事园林植物遗传育种研究。E-mail：zjw@mail.hzau.edu.cn。

梅是原产中国的传统名花，有悠久的栽培历史和丰富的栽培品种，具有极高的观赏价值和经济价值。在生产上，梅花以扦插、嫁接等无性繁殖为主，虽然能保持品种的优良性状，但是繁殖系数小，周期长。利用组培快繁技术，不仅可在短期内快速大量繁殖基因型一致的优质苗木，而且可获得无病毒苗木，大大加快了育苗进程和提高了苗木质量。自Harada等[1]开展梅茎段离体繁殖以来，国内外在梅的离体快繁上取得了较快的进展[2-5]，但目前仍存在建立快繁体系的梅花品种少，部分品种在快繁过程中出现顶芽坏死、叶片黄化等难题。小绿萼是武汉地区的梅花老品种，具有极高的观赏价值。本研究旨在分析茎段采集时间、启动和增殖培养基对小绿萼离体繁殖的影响，以期建立其快繁体系，为该品种的应用推广提供一定的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料采于武汉市磨山中国梅花研究中心，除8—9月份停止采样，分别在3—11月中旬采集梅花品种小绿萼（图1-A）1年生枝条，用冰盒带回实验室。

1.2 方法

1.2.1 外植体灭菌及初代培养 采集回来的枝条剪成1～2 cm长的具节茎段，每茎段1～2个腋芽。用洗洁精浸泡 10～20 min，流水冲洗30 min后在超净工作台上用75%乙醇浸润30 s，转入0.1%HgCl2中消毒8～15 min，然后用无菌水冲洗6～7次，无菌滤纸拭干后接种于初代培养基（1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA）;为分析不同初代培养基对腋芽诱导的影响，以4月中旬采集的小绿萼枝条为材料，灭菌后接种至2种不同初代培养基：1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+01 mg/L NAA和1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.5 mg/L KT。每处理20个外植体，重复3次，接种30 d后统计诱导率，污染率在接种后10～15 d内统计。

1.2.2 腋芽增殖培养 将伸长到1～2 cm的腋芽切下，分别转入添加了1.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA的3种基本培养基和添加不同浓度6-BA和NAA组合的QL培养基中，观察腋芽的增殖，每处理10个外植体，重复3次，记录植株高度，生长情况，接种5周后统计腋芽增殖情况。

1.2.3 丛生长度对继代的影响 待腋芽增殖形成的丛生芽伸长到不同长度（0.1、0.5～1、1～2 cm）时，将其从基部切下，放入继代培养基（1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.5 mg/L KT）中观察其生长，每处理5个外植体，重复3次。

1.2.4 生根与移栽 选择生长健壮，株高超过2 cm的试管苗在5种生根培养基中进行生根培养。移栽时先将生根苗连培养瓶一起置于温室内进行为期10 d的炼苗，在此期间逐渐松开并揭去培养瓶的盖子，而后将植株根系上的培养基洗净，移栽到含有泥炭 ∶ 蛭石=1 ∶ 1 （体积比）的塑料盆中。移栽后的第1周塑料盆上覆盖塑料薄膜以保湿，1周后慢慢揭去。

1.2.5 培养条件 培养室温度为（23±2） ℃，空气相对湿度为60%左右，光照度为1 500～2 000 lx，光照周期为14 h/d。

2 结果与分析

2.1 采样时间对腋芽诱导率的影响

茎段接种1周后腋芽开始萌发，2周后腋芽开始伸长，叶片逐渐展开，叶色浓绿（图1-B）。不同时间采集的枝条在初代培养时，污染率和腋芽诱导率差异显著 （表1），4月至6月中旬是最佳采样时期，既可以保证较高的腋芽诱导率，而且污染率相对较低，其他时期采集的枝条污染率高，腋芽诱导率低，不适宜用作离体培养的外植体。

2.2 初代培养基对腋芽诱导的影响

4月采集的小绿萼枝条，接种于2种不同初代培养基中（表2），培养于添加KT的初代培养基中的外植体， 不仅腋芽诱导率高，而且芽伸长快，叶色浓绿，无顶芽死亡、黄化问题。

这与朱军等的结果[6]相一致，即KT对长蕊绿萼腋芽的伸长生长有促进作用。

2.3 基本培养基对腋芽增殖的影响

将伸长长度达到1～2 cm的腋芽接种到添加了1.0 mg/L BA和0.1 mg/L NAA的3种基本培养基（表3）中，芽的增殖和伸长表现出显著差异（表4），QL上培养的腋芽出芽数显著高于改良N6和1/2MS，伸长长度显著高于改良N6。比较3种培养基上腋芽的生长状态以及出芽数和丛生芽平均高度，在增殖培养中采用QL作为基本培养基。

2.4 激素组合对增殖的影响

将伸长长度达到1～2 cm，且长势一致的的腋芽转入添加不同6-BA和NAA浓度组合的QL培养中基中（表5），在6-BA浓度为0.2 mg/L时，丛生芽平均高度随着NAA浓度的升高而下降，但没有达到显著差异，而增殖系数基本没有变化，表明低浓度6-BA不能诱导腋芽增殖;当6-BA浓度为 1.0 mg/L 时，丛生芽平均高度和增殖系数，随着NAA浓度的升高先上升后下降，但丛生芽平均高度的变化没有达到显著水平，而增殖系数达到显著差异;而当6-BA浓度为0.5 mg/L时，植株平均高度和增殖系数， 随着NAA浓度的升高先下降

表1 采样时间对小绿萼腋芽诱导的影响

取样时间 3月 4月 5月 6月 7月 10月 11月

诱导率（%） 16.70±0.15c 75.00±0.16b 80.00±0.06ab 95.00±0.00a 0.00±0.00c 3.70±0.06c 14.70±0.13c

污染率（%） 83.00±0.15a 10.00±0.08b 19.70±0.06b 19.60±0.06b 100.00±0.00a 96.30±0.06a 85.00±0.13a

注：同行不同小写字母表示在0.05水平上存在显著差异。

表2 初代培养基对小绿萼腋芽诱导的影响

编号 培养基 萌芽率（%）

1 1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA 66.70±0.08a

2

1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+0.1 mg/L NAA 78.30±0.10a

注：同列不同小写字母表示在0.05%水平上存在显著差异。

表3 基本培养基对小绿萼腋芽增殖的影响

基本

培养基 平均芽个数

（个） 丛生芽平均

高度（cm） 生长状态

改良N6

1.17±0.29b

0.63±0.12b

叶嫩绿，簇生在基部，茎极度短缩

1/2MS 1.50±0.50b 1.20±0.08a 叶黄绿，愈伤团褐化

QL 3.16±0.77a 1.38±0.43a 叶嫩绿，平展，生长势很强

注：同列不同小写字母表示在0.05水平上存在显著差异。

后上升，且变化值均达到显著差异。最终选用QL+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA作为小绿萼增殖培养基，在此培养基上丛生芽的数量多，且生长正常（图1-C）。

2.5 丛生芽长度对继代培养的影响

将腋芽增殖培养后不同伸长长度的丛生芽，从基部切离后接种于继代培养基，生长表现出显著差异（表3），长度为1～2 cm的腋芽伸长长度最大，生长健壮，叶片平展;而长度为0.1～1 cm的腋芽生长瘦弱，叶片黄化脱落，最后死亡。

2.6 试管苗的生根培养和移栽

切取高度2～3 cm的试管苗，转入不同生根培养基（表6）中生根，培养30～40 d后形成根系（图1-D、图1-E）。植物生长调节剂的种类和浓度对试管苗生根有显著影响，只

表4 BA和NAA组合对腋芽增殖的影响

编号 6-BA浓度

（mg/L） NAA浓度

（mg/L） 丛生芽平均长度

（cm） 增殖系数

1 0.2 0.05 0.96±0.27cd 1.00±0.00d

2 0.2 0.1 0.85±0.10de 1.04±0.00d

3 0.2 0.2 0.63±0.08d 1.00±0.00d

4 0.5 0.05 2.02±0.25a 4.27±0.64a

5 0.5 0.1 0.95±0.05d 1.13±0.06d

6 0.5 0.2 1.28±0.14cb 1.50±0.35c

7 1 0.05 1.26±011cb 1.00±0.00d

8 1 0.1 1.52±0.27b 1.90±0.50b

9 1 0.2 1.43±0.03b 1.00±0.00d

注：同列不同小写字母表示在0.05水平上存在显著差异。

表5 丛生芽长度对继代培养的影响

编号 丛生芽长度

（cm） 继代培养后丛

生芽长度（cm） 生长状况

1 0.1 0.44±0.12a 叶极度卷曲，生长势差

2

0.5～1

1.76±0.53b

叶嫩绿，平展，有轻微玻璃化，边缘黄化

3 1～2 2.70± 0.56c 叶嫩绿，平展，生长势极好

注：同列不同小写字母表示在0.05水平上存在显著差异。

添加了生长素IBA的培养基生根率很低，仅为3.33%，且愈伤组织多。同时添加NAA和IBA的培养基以及添加IBA和活性炭的培养基，生根率、平均生根数和平均根长显著增加，但生根效果最佳的是试管苗先用200 mg/L IBA 浸渍，再培养于 1/2QL 培养基的处理，生根率达到最高（80%），与其他处理相比差异显著，且平均根长和根数也显著增加。生根后的植株先在温室炼苗10 d左右，然后移栽入塑料盆中（图1-F），移

表6 生根培养基对小绿萼试管苗生根的影响

编号 生根培养基 生根数（条） 根长（cm） 生根率（%）

1 1/2QL+0.2 mg/L IBA+0.3 mg/L NAA 1.60 ±0.17b 5.88±2.42a 36.67±0.15b

2 1/2QL+0.5 mg/L IBA 0.33±0.58b 0.84±1.46b 3.33±0.06c

3 1/2QL+0.05 mg/L IBA 0.33±0.58b 0.67±1.16b 3.33±0.06c

4 1/2QL+200 mg/L IBA 浸渍 3.81±1.78a 4.82±1.10a 80.00±0.10a

5 1/2QL+0.1 mg/L IBA+1 g/L活性炭 1.00±0.00b 3.29±1.14ab 36.67±0.06b

注：同列不同小写字母表示在0.05%水平上存在显著差异。

栽存活率可达90%。

3 讨论

3.1 外植体生理状态对启动培养的影响

3月份梅花枝条上的叶芽开始膨大，萌发抽生新枝，但此时的枝条过于幼嫩，容易受灭菌剂的影响而褐化死亡，同时污染率也较高，因此本试验中3月取样的茎段萌芽率低;4—6月为梅新梢生长旺盛期，本试验在此阶段取样的茎段萌芽率最高可达90%，且新叶嫩绿，生长强健。这一结果与傅萼辉等、曲春苗等的研究相一致，即早春萌动的腋芽是比较理想的离体培养外植体，因为此时内源IAA浓度较高[7-9]，有利于腋芽的萌发与生长。但与Yonemitsu等的试验结果相反，他们认为当年11月到翌年2月在休眠枝上采集的冬芽，离体繁殖的成功率高，造成这种差异的具体原因尚需进一步的分析[10]。

3.2 基本培养基对增殖培养的影响

在其他培养条件相同的情况下，果梅品种Nanko早春萌发的新芽，在WPM培养基上离体微繁时能增殖且生长健壮，而在MS培养基上的芽会逐渐褐化死亡[1]。而吕英民等离体培养铁骨红1年生枝具节茎段时，通过比较外植体在6种基本培养基（QL、MS、WPM、M1、M2、M3）上腋芽增殖系数、平均伸长长度等指标的差异，认为QL是适合铁骨红生长的最佳基本培养基[4，11]。本试验在小绿萼腋芽的增殖培养时，比较了改良N6、1/2MS和QL基本培养基对其增殖和生长的影响，也发现QL基本培养基显著优于改良N6和1/2MS。

3.3 KT和BA对腋芽萌发和伸长的影响

组织培养中常用的细胞分裂素有6-BA、KT和ZT，对梅花的增殖有不同的效果。从铁骨红试管苗增殖培养的结果看，6-BA和ZT优于KT，而且增殖系数差异显著。但增殖培养基中不添加IAA、IBA或NAA等生长素，增殖芽的伸长生长慢，影响试管苗正常生长。细胞分裂素浓度过高，增殖芽数量虽然明显增加，但多呈丛生状，茎难以伸长，且生长细弱，叶小且叶色异常，甚至出现玻璃化苗[12]。为克服增殖苗生长瘦弱，不得不采用壮苗培养基[7]。本试验在小绿萼腋芽增殖培养中所选用的3个6-BA浓度中，最适的浓度为0.5 mg/L，在添加此浓度6-BA的培养基中，不仅增殖系数最大，且丛生芽平均伸长长度也较大，当6-BA浓度提高到1.0 mg/L，虽然产生了大量的丛生芽，但是继代培养时丛生芽往往发生严重的褐化和黄化，渐渐死亡，同时玻璃化或畸形现象也逐渐加强，因此，在增殖培养中6-BA的浓度选定为0.5 mg/L。

3.4 浸渍法对生根培养的影响

在诱导梅试管苗生根时，既有单独使用IBA或NAA的报道，也有同时使用IBA和NAA的报道[1，4，6，11]。Harada 等在研究生长素对Nanko试管苗生根影响时发现，高浓度的IBA（1～2 mg/L）或NAA（0.9～1.9 mg/L）容易使试管苗基部形成愈伤，本试验在生根培养基中添加0.5 mg/L也易导致小绿萼试管苗形成大团愈伤。吕英民等在进行铁骨红试管苗生根培养时，观察到生长素种类对生根影响显著，其中NAA生根率较高，并且试管苗须根较多，但是根系比较细弱;添加IBA的试管苗根比较粗壮，但是根系较少;同时使用2种植物生长调节剂时不仅发根多，而且生长粗壮。但在本试验中，IBA和NAA同时使用虽然生根数和生根率较单独使用有所增加，但生根率偏低，而用200 mg/L IBA浸渍试管苗后培养于 1/2QL，其生根率可达80%，且平均生根数有显著增加，此结果与新疆野生巴旦杏的生根试验相似[13]，其试管苗用 100 mg/L IBA浸渍处理60 min后转入1/2MS培养基中培养，暗培2周后生根率可达100%。

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[12]朱 军，张宇实，郭立春，等. ZT、IAA 对梅花试管苗增殖与生长的影响[J]. 江苏林业科技，2004，31（2）：18-19.

[13]曾 斌，罗淑萍，李 疆. 新疆野生巴旦杏的组织培养和植株再生[J]. 新疆农业大学学报，2006，29（4）：27-31.