酵母细胞表面上无机壳层的制备

姚成立+金涛+田宁宁

摘要：分别介绍了在酵母细胞的有氧呼吸过程中制备碳酸钙外壳以及通过LBL自组装方式结合维生素C的还原作用制备银质外壳。结果表明，上述2种方式能有效防止酵母被化学试剂毒害，为未来的功能细胞研究奠定基础。

关键词：酵母;细胞壳;自组装;碳酸钙;银质外壳;制备

中图分类号： Q813 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）04-0044-03

收稿日期：2014-05-02

基金项目：国家级大学生创新创业训练计划（编号：201314098038）;合肥师范学院校级科研项目（编号：2014cxy25）。

作者简介：姚成立（1975—），男，安徽枞阳人，硕士，高级实验师，主要从事生物无机化学研究。Tel：（0551） 63674145;E-mail：yaochengli@hftc.edu.cn。

细胞壳具备“外衣”功能在自然界并不少见，禽蛋、蚕茧和硅藻等皆属于有壳保护的细胞。蚕茧在蚕蛹的生长发育过程中抵御外界的机械压力、毒性物质和天敌的攻击，传递蚕蛹的生命周期信息。蛋壳为胚胎发育提供了机械支持，并且维持它的生物活性。在硅藻和放射目的生物中，细胞壁外面密集排列的囊泡阵列，连续的硅骨架就在囊泡泡沫周围的膜边界成核，在硅藻细胞进入休眠期时为其提供保护外界的环境侵扰。若能以有壳细胞为启示，通过为活细胞人工制造壳结构来改进细胞固有的性质和功能，会是一个极大的挑战。与单细胞生物不同，真核细胞往往是被复杂的细胞外基质包裹和支持着，缺乏外壳的保护。目前的研究结果表明，通过生物硅化法、水凝胶法、聚电解质法LBL技术、静电匹配直接沉淀法给真核细胞做外衣技术也已经有了可能，而且这些外衣为细胞的储存、抵御有毒有害抗紫外线的能力大大加强。聚电解质法和静电匹配法在构建细胞外壳时，是基于金属纳米粒子或者金属离子与细胞表面的官能团—COOH或—NH2相互作用，在经化学修饰后表面具备异种电荷的细胞表面产生吸附作用[1-2]。目前使用经聚合物分散稳定的磁性纳米粒子，成功在酵母[3-6]、细菌、微藻类、霉菌[7]的外表面上包裹上均匀PAH-四氧化三铁纳米粒子单层，这些磁性纳米粒子在蛋白质分离、细胞收集、药物缓释等方面具有广泛的潜力[8]。在酵母等细胞上已经成功地裹上了碳酸钙[9-11]，碳酸钙微壳（球霰石）直接沉积到酵母表面发生在沉淀过程中的Ca2+和CO2-3相遇在水溶液中的几分钟之内，所得到的核-壳“无机物@细胞”结构在水溶液中是稳定的，并且可以被存储为几个月，同时保留了细胞的生存能力。非常有趣的是，随着酵母细胞的不断分裂，体系中球霰石通过重结晶最终形成较大的方解石微粒。磷酸钙壳通过LbL方式在酵母细胞的表面形成聚电解质壳，随后在对细胞的钙与磷酸盐原位矿化。这种方式是通过聚电解质壳静电吸引Ca2+，接着形成无定形磷酸钙结构层，即相对厚约1 mm的矿物层[12]。此外，SiO2[13]、聚多巴胺[14]、TiO2[15]、氧化石墨烯[16]等细胞外壳液相继制备，上述壳化细胞在细胞储存、细胞保护、细胞输送以及细胞治疗等方面具有广阔的应用前景，细胞壳化为调控和功能化细胞提供了一条行之有效的思路和策略。但上述合成方法都比较繁琐，过多采用化学试剂不可避免会对酵母细胞产生毒害，从而降低试验的成功概率。本研究介绍了通过酵母细胞的有氧呼吸产生CO2为碳源制备碳酸钙外壳，以及在维生素C的还原作用下制备银质细胞外壳。试验结果表明，通过酵母自身的呼吸来提供碳源以及维生素C的还原作用降低了外在的化学毒素对细胞毒害的可能，为未来大量制备无机壳化的细胞提供了可能。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

酵母（Yeast，湖北安琪酵母有限公司）;氯化钙（分析纯）、氯化钠（分析纯）、无水乙醇（分析纯）、浓氨水（分析纯）、维生素C（分析纯）、硝酸银（分析纯）、磷钨酸钠（PTA，分析纯）、聚二烯基丙二甲基氯化铵 （PDADMAC，分析纯）、葡萄糖（生化试剂）、蛋白胨（生化试剂），均购自国药集团上海化学试剂有限公司，试验用水全部为无菌水。红外光谱用Nicolet870傅立叶红外光谱仪测试，KBr压片（扫描范围4 000～400 cm-1，扫描32次，分辨率4 cm-1），微观粒子形貌在日本日立S-4800或1510扫描电子显微镜上完成，离心工作在低速台式离心机（TDL-50C）上完成。

1.2 酵母细胞的培育

从市场购买的干酵母粉用无菌水溶解，在合适的温度和营养下激活细胞，具体操作如下：在恒温30 ℃、转速为 220 r/min 的摇床中培养，培养液为YPD培养基（2%蛋白胨、1%酵母粉悬浮液、2%葡萄糖）。经过12 h的指数生长期之后，酵母细胞被离心收集（1 500 g）并用0.15 mol/L氯化钠溶液清洗。

1.3 酵母细胞诱导碳酸钙的制备

取2 mL酵母悬浮液和葡萄糖于250 mL经无菌处理过三角烧瓶中，快速倒入50 mL 0.05 mol/L CaCl2溶液中，同时加入一定量的氨水，调节pH值至微碱性，搅拌30 min，通入一定量的O2后用保鲜膜将三角瓶瓶口扎紧，置于恒温30 ℃、转速220 r/min的摇床上，经48 h呼吸作用后离心，收集三角瓶中的沉淀物，分别用去离子水和无水乙醇各洗涤3次，真空干燥6 h，再将固样放在马弗炉中400 ℃下焚烧，收集白色粉末，待测。

1.4 酵母细胞银质壳的制备

取1 mL酵母悬浮液并分散在1 mg/mL PDADMAC溶液中，置于恒温30 ℃、转速220 r/min的摇床上摇晃15 min，然后在2 000 r/min下离心2 min，收集沉淀，弃除多余的PDADMAC，接着用无菌水洗涤沉淀细胞2次;再将洗涤后的酵母细胞分散于1 mg/mL磷钨酸溶液中，接下来的操作过程如前所述，共循环3次，形成Yeast/PDADMAC/PTA自组装包裹结构;再将上述包裹结构分散于0.05 mol/L AgNO3溶液中，在摇床上摇晃15 min，添加0.05 mol/L 维生素C溶液，继续摇晃15～30 min，在转速2 000 r/min下离心2 min，收集沉淀待测。