S100A16蛋白多克隆抗体表达条件的优化

翟晓虎+贺卫华+沈晓鹏+陈世杰

摘要：探索优化并构建S100A16原核表达载体、制备S100A16蛋白多克隆抗体的条件。试验方法为，将RT-PCR扩增得到的小鼠肝脏组织的S100A16基因克隆片段连接到带有His标签的原核表达载体pET-28a多克隆位点，并转化大肠杆菌BL21（DE3），用不同温度、不同浓度IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）诱导融合蛋白表达，通过亲和层析柱纯化获得纯化的蛋白质。经免疫动物得到His-S100A16抗血清，通过免疫亲和层析获得了具有高度特异性抗体，通过Western Blot和Elisa检测抗体的特异性和效价，结果表明，在温度25 ℃、IPTG浓度为0.2 mmol/L的条件下，可溶性蛋白的表达效果较好。

关键词：S100A16;Western Blot;融合蛋白表达;ELISA;小鼠

中图分类号： Q785 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）04-0039-02

收稿日期：2014-04-01

基金项目：江苏省泰州市农业项目（编号：TN2013012）。

作者简介：翟晓虎（1981—），男，山西浑源人，硕士，讲师，主要从事小动物疾病方面的研究。Tel：（0523）86651732;E-mail：zhaixiaohu010@163.com。

S100A16基因是在应用全基因组微阵列芯片技术筛查代谢性疾病相关基因的研究中新获得的差异表达基因，是钙调蛋白S100家族的新成员，除了具有S100家族的基本结构特征，还存在更复杂的调节机制。S100家族在细胞的增生、分化、迁移与凋亡，神经轴突的生长与认知形成及肿瘤发展中均发挥着重要作用[1]。关于其新成员S100A16基因与疾病发展的研究尚浅，目前尚无明确结论，经有关科研机构研究，初步阐明S100A16基因在代谢性疾病的发生发展中发挥作用。本研究拟探讨并优化S100A16多克隆抗体的制备条件与方法。

1 材料与方法

1.1 试验动物

新西兰白兔，购自江苏省农业科学院，成年公兔体质量4～5 kg，母兔体质量4.5～55 kg。

1.2 试验仪器

主要试验仪器有：Eppendrof 5810冷冻离心机，凝胶成像仪，BioTek酶标仪，BioTek洗板机，普通PCR仪，冷冻离心机，Thermo电动移液器，Nuaire生物安全柜，三洋高压灭菌锅，Revco超低温冰箱，Milipore纯水仪，制冰机，振荡器，分光光度计，电泳设备，国产大龙移液器。

1.3 试验试剂

PBS（磷酸盐缓冲液，含蛋白酶抑制剂、1%TritionX-100、5%甘油）、PBST（磷酸盐吐温缓冲液）、1 L TBS（Tris-HCl缓冲盐溶液）、TBST 洗脱液（1 L TBS溶液中加0.5 mL Tween20）、LB培养基、SDS（十二烷基磺酸钠）电泳液、转膜液、封闭液、10% SDS、10% APS、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O、EDTA（乙二胺四乙酸二钠）、UREA（尿素）、PMSF（苯甲基磺酰氟）、IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）、AMP（氨苄西林）、卡那霉素（Kana）、曝光显色剂、025%考马斯亮蓝G250、脱色液等。

1.4 试验方法

1.4.1 接种活化 接种活化方法按常规方法进行。

1.4.2 传代培养 于灭菌三角摇瓶内加50 mL LB（含50 μg/mL Kana），接种1 mL已转化His-S100A16的大肠杆菌BL21（DE3）过夜活化，于37 ℃、220 r/min培养5～6 h。

1.4.3 扩大培养 在1 L灭菌三角摇瓶内加450 mL LB（含50 μg/mL Kana），接种50 mL传代His-S100A16转化的大肠杆菌BL21（DE3），于37 ℃、220 r/min条件培养1～2 h。

1.4.4 诱导培养 待扩大培养的His-S100A16的D600 nm约为0.6时，取500 μL菌液留样，再加诱导剂IPTG，150 r/min 下过夜诱导。为了使蛋白尽量以可溶性形式表达，试验设5个温度条件，A、B、C、D、E组分别为16、20、25、30、37 ℃，每个组的IPTG浓度均设4个梯度：0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L。

1.4.5 菌体收集处理 （1）菌体收集：先取500 μL菌液，于12 000 r/min离心2 min，弃上清，加100 μL 1×loading buffer，用漩涡器将EP管底部菌体打散，在干式恒温器中96 ℃变性10 min;然后于12 000 r/min离心2 min，转移上清到新的EP管中，作标记后-20 ℃保存;取出后于4 ℃、6 000 r/min离心15 min，弃上清。（2）破碎（冰上操作）：加30 mL PBS混匀菌体沉淀[2]。（3）超声：在冰水混合物中进行，超声条件：65%Amp， 超声3 s，间歇5 s，累计10 min，超声后离心：4 ℃、12 000 r/min 离心5 min，取上清，0.22 μm滤器过滤。（4） SDS电泳检测。

1.4.6 过柱纯化和超滤 （1）His-S100A16蛋白纯化（冰上操作）。（2）稀HCl清洗系统20 min，75%乙醇清洗系统 20 min，水洗系统20 min，绑定5 min，调节流速为1 mL/min，连接His-Trap柱，绑定15 min，平衡柱，上样;过滤，绑定洗杂蛋白20 min，洗脱，接8管，每管1 mL，绑定，加20%乙醇[3]。（3）超滤S100A16蛋白：根据蛋白电泳的结果，混合纯化的S100A16，用PBS置换buffer（向加入样品的超滤管中加入PBS，几乎加满后离心，保留滤液，洗2次;用考马斯亮蓝G250测蛋白浓度，如果还有蛋白则收集后再次超滤，超滤至考马斯亮蓝G250测蛋白浓度颜色较深为止），收集S100A16蛋白，SDS电泳检测S100A16。