氨基糖苷类抗生素耐药机制研究进展

王梓，孔令聪，贾博岩，刘树明，马红霞，2∗

（1.吉林农业大学动物科技学院，长春130118；2.吉林农业大学动物生产及产品质量安全教育部重点实验室，长春130118）

氨基糖苷类抗生素耐药机制研究进展

王梓1，孔令聪1，贾博岩1，刘树明1，马红霞1，2∗

（1.吉林农业大学动物科技学院，长春130118；2.吉林农业大学动物生产及产品质量安全教育部重点实验室，长春130118）

分别从氨基糖苷类抗生素修饰酶、核糖体靶位修饰、药物的主动外排系统3个方面对近年来氨基糖苷类抗生素耐药机制的最新研究进展做以综述，以期为临床合理应用氨基糖苷类抗生素及控制致病菌氨基糖苷类耐药性提供参考。

氨基糖苷类抗生素；耐药性；耐药机制

氨基糖苷类抗生素因其对革兰氏阴性菌的杀菌作用，以及可与β-内酰胺类抗生素联合应用等诸多优势得到了广泛的开发与应用，但随之产生的细菌耐药问题也日趋严重，相关研究已证明细菌对氨基糖苷类抗生素耐药机制主要包括：氨基糖苷类修饰酶对抗生素的修饰作用，细菌靶位修饰及药物的主动外排［1］。近年来，科研工作者利用分子生物学技术发现了更多新型氨基糖苷类修饰酶，并对外源性16S rRNA甲基化酶对内源性甲基化酶的影响及功能外排泵表达的调控等耐药机制进行了更深入的研究。为此，本文将对上述氨基糖苷类抗生素主要耐药机制的研究进展做以综述。

1 氨基糖苷类抗生素修饰酶

1.1 氨基糖苷类修饰酶分类及分布 细菌产生的氨基糖苷类抗生素修饰酶是介导氨基糖苷类耐药最为广泛的途径，即通过修饰酶对氨基糖苷类抗生素结构进行修饰，使其无法作用于细菌产生耐药性。氨基糖苷修饰酶根据其对2-脱氧链酶胺上-OH或-NH2催化作用的不同可分为乙酰基转移酶类（AACs）、腺苷酰转移酶类（ANTs）及磷酸转移酶类（APHs）。其中，乙酰基转移酶类对1［AAC（1）］，3［AAC（3）］，2’［AAC（2’）］，6’［AAC（6’）］位进行催化乙酰化；腺苷酰转移酶类对6［ANT（6）］，9［ANT（9）］，4’［ANT（4’）］，2’’［ANT（2’’）］，3’’［ANT（3’’）］位进行催化腺苷酰化；磷酸转移酶类对氨基糖苷分子上的磷酸盐基团进行催化转移，其可分为：APH（4）-I，APH（6）-I，APH（9）-I，APH（3’）-I-VII，APH（2’’）-IIV，APH（3’’）-I，APH（7’’）-I子类［2］。氨基糖苷类抗生素修饰酶具有众多亚型的同时，其分布范围也十分广泛。Pak-Leung Ho等在香港对所分离188株氨基糖苷类抗生素耐药的大肠杆菌进行耐药基因检测发现，91%的受试菌株携带有aac（3）-II基因，12.2%的受试菌株携带aac（6’）-Ib／Ib-cr基因［3］。Bjørg C.Haldorsen等在挪威对临床分离的大肠杆菌及肺炎克雷伯菌进行耐药基因检测，分别扩增出aac（3）-II、aac（6’）-Ib、ant（2’’）-Ia等多种耐药基因［4］。Reza Ghotaslou等在伊朗分离出的阴性葡萄球菌中检测出aac（6’）-Ie-aph（2’）-Ia，ant（4’’）-Ia，aph（3’）-IIIa等多种耐药基因［5］。近年来，世界范围内有关氨基糖苷类修饰酶的报道逐年增多，且其分布范围也逐渐扩大，由于氨基糖苷类修饰酶基因可定植于染色体或质粒上的整合子、基因盒、转座子等元件中，故在致病菌中具有极快的传播能力。

1.2 多重修饰酶作用 近年来，有关氨基糖苷类抗生素多重修饰酶的报道逐年增多，研究证明，部分多重修饰酶对细菌氨基糖苷类耐药性具有增强作用。Shangshang Qin等在氨基糖苷类耐药的肠弯曲杆菌染色体中发现一个新基因岛，其包含有aadE -sat4-aphA-3、aacA-aphD多重氨基糖苷修饰酶簇［6］。Min Yuan等对多重氨基糖苷修饰酶介导的威替米星耐药性进行研究，结果显示AAC（6’）-Ie -APH（2’’）-Ia双功能酶可使受试菌对威替米星的敏感性降低39～116倍［7］。Keith D.Green等对多种双功能修饰酶作用进行研究，结果显示，多数双功能修饰酶的第二种酶无法发挥其对药物的修饰作用，但AAC（3）-Ib／AAC（6’）-Ib’双功能修饰酶可以对庆大霉素产生双重乙酰化作用，提高细菌的耐药水平［8］。可见，近年来细菌携带的氨基糖苷类修饰酶已由单一修饰酶介导耐药转向多种修饰酶共同作用形成的多重修饰酶基团，其介导的耐药性也逐渐增强，随着诸多修饰酶基因在质粒等媒介中的快速传递，将会产生更多多重修饰酶。故对氨基糖苷类抗生素多重修饰酶进行检测的同时，继续探究其耐药机制，将对抗菌药物的应用及新型药物的研发发挥重要作用。

2 核糖体靶位修饰

2.1 16S rRNA甲基化作用

2.1.1 16S rRNA甲基化酶的发现及作用机制16S rRNA甲基化酶在细菌中较为常见，其可帮助细菌30s核糖体结构的形成。而介导氨基糖苷类高水平耐药的16S rRNA甲基化酶最早发现于产氨基糖苷的放线菌中，如链霉菌属及小单胞菌属［9］。其可通过菌体内16S rRNA甲基化酶的甲基化作用，对其自身产生的氨基糖类物质形成高水平耐药，使其在复杂的微生物环境下形成生态学优势。Keiko Yokoyama等首次在绿脓杆菌中发现了由质粒携带的外源性16S rRNA甲基化酶rmtA基因，其可介导除链霉素外绝大多数氨基糖苷类抗生素的高水平耐药（MIC＞1024 μg／mL）［10］。从此，质粒／转座子携带的外源性16S rRNA甲基化酶在世界范围内陆续发现，且种类也逐渐增多。因其可以在不同细菌间快速水平传播并不受菌属特异性限制，近年来外源性16S rRNA甲基化酶介导的耐药性已成为氨基糖苷类抗生素高水平耐药的主要途径。各外源性16S rRNA甲基化酶概况如表1所示。

外源性16S rRNA甲基化酶主要通过修饰30s核糖体亚基N7-G1405及N1-A1408位，使细菌对氨基糖苷类抗生素产生较高耐药性［11］。其中ArmA，RmtA-RmtF作用机制皆为对N7-G1405位发挥甲基化作用，使细菌产生对4，6-二取代2-脱氧链酶胺类如阿米卡星、妥布霉素、庆大霉素等抗生素的耐药［12］。NpmA的作用机制为对N1-A1408位发挥甲基化作用，通过此甲基化作用能够使细菌同时产生对4，6-二取代2-脱氧链酶胺及4，5-二取代2-脱氧链酶胺类的耐药性［13］。

表1 外源性16S rRNA甲基化酶基因概况表

2.1.2 外源性16S rRNA甲基化酶对内源性甲基化酶的影响 研究发现，外源性16S rRNA甲基化酶基因的G+C含量普遍在30%～55%之间，而内源性甲基化酶基因的G+C含量大多高于60%，由此证明，两者具有较低的同源性［22］。而在其各自作用于30s核糖体亚基并发挥甲基化作用时，是否存在相互影响已引起科研人员的广泛关注。Belen Gutierrezd等对内源性甲基化酶RsmF，及外源性介导氨基糖苷类抗生素高水平耐药的甲基化酶Arm／Rmt的相互影响进行了深入探究，分别通过构建单基因、多基因共存大肠杆菌模型发现：在同时存在Arm／Rmt及RsmF甲基化酶时，外源性Arm／Rmt酶甲基化16S rRNA m7G1405位的同时，会抑制RsmF对m5C1407位的甲基化作用。同时还发现携带有RsmF酶的受试菌在抗生素压力下具有更强的存活能力，证实了其作为内源性16S rRNA甲基化酶，在发挥修饰30s核糖体亚基作用的同时，还能够影响细菌对氨基糖苷类药物的敏感性［23］。Virginia S.Lioy等对外源性甲基化酶NpmA、ArmA及内源性甲基化酶RsmF、RsmI作用的相互影响进行了研究。结果显示，NpmA酶在修饰A1408位同时，能够影响RsmF对C1407位的修饰作用，ArmA在修饰G1405位的同时，可以干扰RsmI对C1402位的甲基化作用。但在C1402位未发生甲基化修饰时会对细菌产生生长性损伤，而缺少C1407位修饰的细菌在生长过程中则未见影响［24］。

目前，有关内外源甲基化酶间相互影响的研究正在逐渐深入，通过探究细菌内源性甲基化酶翻译的准确性及细胞适应性的影响，可以更加全面的阐述外源性16S rRNA甲基化酶的起源及作用机制，并对内源性甲基化酶在氨基糖苷类抗生素耐药中发挥的作用进行评估，具有重要意义。

2.2 核糖体靶位突变 目前，由核糖体30s亚基点突变介导的2-脱氧链酶胺类氨基糖苷耐药只发生于分枝杆菌属中。这是因为分枝杆菌属的核糖体操纵子为单拷贝，当编码16S rRNA的rrs基因发生碱基突变时，会影响两段高度保守区：相当于大肠杆菌530环及氨基酸912区，进一步导致其对药物的亲和力降低从而引起耐药［25］。Rachid Nessar等对化脓分枝杆菌16S rRNA碱基突变介导的氨基糖苷类耐药机制进行了深入的研究，除已知的A1408G突变位点外，发现另外三个rrs基因突变位点：T1406A，C1409T，G1491T。其中1406及1408位突变为耐药表型，而1409及1491位突变为敏感表型［26］。

3 药物的主动外排系统

3.1 减少药物在菌体内蓄积途径 早期研究发现，因药物跨过细菌细胞膜需依靠ATP供能，故由ATP合成酶功能基因的碱基突变可导致药物跨膜失败，形成耐药性，这种耐药方式最早出现在氨基糖苷类抗生素耐药的大肠杆菌及铜绿假单胞菌中［27］。此外，目前认为介导菌体内药物蓄积减少的主要机制为细菌的主动外排系统，这些外排系统可在条件致病菌长期药物压力下过量表达，从而导致高水平耐药［25，28］，其中由RND（resistance nodulation cell division）家族的MexY，AmrB，AcrD等转运蛋白组成的外排系统对氨基糖苷类抗生素具有较强的外排作用，可使携带有这些外排泵的细菌产生氨基糖苷耐药［29］。

3.2 功能外排泵表达的调控机制 近年来，相关研究发现，氨基糖苷类抗生素的主动外排多由RND家族介导，而该家族中常见介导氨基糖苷类耐药的MexXY外排泵基因的表达量可由多种因素影响。Sebastien Fraud等在对铜绿假单胞菌外排泵研究中发现，当受试菌暴露于ROS（reactive oxygen species）环境压力下时，可以造成MexXY组分中PA5471基因的过量表达，从而增加了MexXYOprM多药外排系统的表达，导致受试菌对氨基糖苷类耐药水平的提高。过量表达的MexXY基因中发现了4处突变位点，且突变位点均不在MexXY的抑制区MexZ内［30］。研究证明：条件致病菌在富氧或过氧化物环境中长期诱导下，可以提高MexXY基因的表达量，继而增强了细菌对氨基糖苷类抗生素的耐受能力，而在细菌所致的肺部感染等病例中即可形成上述富氧环境，从而通过外排基因的过量表达产生高水平氨基糖苷类耐药。Sophie Guénard等对MexXY基因阻遏蛋白MexZ的表达调控机制进行了深入研究。发现如下三类氨基酸碱基突变均可抑制MexZ基因的表达，进而使MexXY基因不受抑制作用而大量表达，产生对氨基糖苷、氟喹诺酮等抗生素的高水平耐药。其中第一种类型为agrZ型突变，即MexZ基因内部碱基发生点突变使其内部结构发生变化，从而影响其自身的表达；第二种为agrW1型突变，该突变发生于编码MexZ阻遏蛋白AmrZ的PA5471基因上，从而影响MexZ基因的表达；第三种为agrW2型突变，该突变通常为单氨基酸突变并发生于ParRS（组氨酸激酶传感器）基因上，该基因可调控MexXY的表达水平，从而提高耐药菌对氨基糖苷等抗生素的耐药性［31］。研究表明，MexXY-OprM外排系统的表达量可以受多种因素调控，其中编码阻遏蛋白基因上碱基位点的突变，因其突变位点的多样性已成为控制细菌外排系统亟需解决的问题之一。现有研究发现，在MexAB-OprM外排系统中，将merR与mexA基因之间一段大小为3 bp的碱基片段敲除后，可以降低该外排泵的表达量，从而降低受试铜绿假单胞菌对氨基糖苷类抗生素的耐药性［32］，MexXY-OprM外排系统中是否存在相似的表达调控方式还有待进一步研究。

4 展望

综上所述，近年来科研人员对氨基糖苷类抗生素耐药机制的研究正不断完善，使我们对细菌氨基糖苷类耐药途径产生了较完整的认知。目前，氨基糖苷类抗生素仍广泛应用于革兰氏阴性菌引起的感染中，而耐药菌的广泛产生大大降低了其使用效益，增加了治疗成本，故如何在新型抗菌药物开发的同时，充分利用细菌耐药机制的研究成果，通过设计氨基糖苷修饰酶抑制剂，反义RNA等手段控制细菌的耐药性已成为亟需解决的问题之一。同时，对于细菌耐药机制的研究更应持续进行，使广大科研人员最终将耐药菌危害降到最低成为可能。

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（编辑：侯向辉）

Research Progress of Resistance Mechanism of Aminoglycosides

WANG Zi1，KONG Ling-cong1，JIA Bo-yan1，LIU Shu-ming1，MA Hong-xia1，2∗
（1.College of Animal Science and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China；2.Animal Production＆Product Quality and Security，Ministry of Education，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China）

This paper mainly summarized the new researches about the resistance mechanism of aminoglycosides in order to provide some reference resources for rational using of aminoglycosides and controlling the production of drug-resistance.

aminoglycosides；resistance；drug-resistant mechanism

2015-01-29

A

1002-1280（2015）03-0065-05

S859.796

国家自然科学基金项目（31140026）；吉林省世行贷款农产品质量安全项目（2011-Y05）

王梓，硕士研究生，从事动物药理和毒理学研究。

马红霞。E-mail：hongxia0731001＠163.com