局灶性脑缺血大鼠脑组织CD20的表达

夏光明，倪小红，王洲羿，黄虎翔，肖展翅，刘秋梅，李 钢

CD20作为跨膜的蛋白质是一种新型钙通道，CD20的激活是调节内源性钙离子变化的又一个影响因素，并通过钙离子变化直接调节钙离子通道活性。本研究采用大鼠局灶性脑缺血模型，用免疫组化和计算机图像分析技术检测局灶性脑缺血CD20的表达情况，初步探讨CD20在局灶性缺血脑组织中的变化。

1 材料与方法

1.1 动物及实验分组 雄性健康SD大鼠28只，体重200 g～250 g，由武汉大学实验动物中心提供。饲养室内温度25℃，自由进食。实验室温度25℃，实验前12 h禁食禁水。大鼠随机分为假手术组及大脑中动脉阻塞（MCAO）后3 h组、6 h组、24 h组。实验分批进行，每批含各组大鼠7只。

1.2 试剂与仪器 免疫组化试剂盒购自武汉谷歌生物技术有限公司。

1.3 动物模型的制作 大鼠用10%水合氯醛（35 mg／kg）腹腔注射麻醉。仰卧位固定，颈正中线左侧旁开约0.5 cm切口，沿胸锁乳突肌内缘分离肌肉和筋膜，分离左侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA），结扎颈外动脉远心端，用微动脉夹暂时夹闭CCA主干以及ICA入颅部。然后在ECA残端剪0.3 mm小口，将线拴插入，轻推尼龙线尾端经CCA分叉部沿ICA入颅，遇到阻力，大鼠呼吸心跳加快时停止。尼龙线插入深度从CCA分叉部计18.5 mm±0.5 mm。结扎ECA开口近心端，放开CCA动脉夹，缝合伤口，单笼饲养观察。参考Longa等［1］的方法进行动物清醒后爬行行为障碍评分：无神经功能缺失症状，活动正常者0分；提尾时病灶对侧前肢不能完全伸直者1分；爬行时出现向对侧转圈者2分；行走时身体向对侧倒者3分；不能自行行走，意识丧失者4分。1分～3分为入组标准。

1.4 免疫组织化学染色 大鼠以10%水合氯醛（35 mg／kg）腹腔注射麻醉。开胸经左心室插管至主动脉，夹闭腹主动脉。依次灌注生理盐水250 mL，4%多聚甲醛PBS缓冲液150 mL。在3 h、6 h和24 h时间点取出全脑，在多聚甲醛中于4℃下固定36 h。常规乙醇梯度脱水透明、石蜡包埋，用切片机自视交叉处向后连续冠状切片，片厚7μm。按改进的Stermberger PAP法进行CD20免疫组织化学染色，二氨基联苯胺显色系统显色；流水终止反应后苏木素复染，盐酸乙醇分化，清水返蓝，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中型树脂封片观察。细胞被染成棕褐色为阳性结果。同时做抗体的交叉性试验及空白对照实验。

1.5 病理组织观察 取免疫组化反应阳性切片的相邻切片作HE染色，进行病理观察。

1.6 CD20阳性神经元计数 取大脑切片的同一层面梗死灶及其周边选择上下左右及中央5个视野，在400倍光镜下计数CD20阳性神经元的数量，所得阳性细胞数取平均值。

1.7 统计学处理 计量数据用均数±标准差（x±s）表示，组间差异采用t检验。

2 结 果

2.1 动物行为特征 手术组动物在麻醉清醒后均呈现局灶性脑缺血表现：右前爪不能前伸，向右旋转爬行或倾倒。

2.2 HE染色观察结果 缺血3 h组神经元出现变性；缺血6 h组见皮质、海马神经元呈空泡变性；缺血24 h组大部分神经元完全坏死，神经元数量减少，残存神经细胞核变小、颜色深染。

2.3 CD20免疫组化染色 非梗死侧无阳性神经元分布。缺血3 h未发现CD20阳性神经细胞；缺血6 h出现CD20阳性神经元，但着色较淡，弥散分布，多数表达于细胞膜，少数同时表达细胞浆中。在梗死灶边缘与正常脑组织交界处CD20阳性神经元分布有一明显的分界线。在梗死灶中细胞坏死明显，CD20表达于细胞浆中。在梗死后6 h和24 h两个时间点，CD20阳性神经元的数量变化明显（P＜0.01）。详见表1。

表1 梗死灶阳性CD20神经元计数（x±s）

3 讨 论

CD20分子为膜结合型蛋白，位于细胞膜上的脂斑区，由297个氨基酸组成的非糖基化磷蛋白，4次穿过细胞膜，带有3个疏水基。分为胞外段、跨膜区和胞内区三部分。胞外区基因长132bp，编码44个氨基酸［2］。CD20是新型钙通道，发生交联甚至超交联时形成的多聚体发挥钙通道的功能，使细胞外钙离子流入细胞内；同时CD20靠近脂斑区Src家族的酪氨酸蛋白激酶并相互激活，启动信号传导途径，动员内源钙库。使细胞内钙超载，进一步导致细胞凋亡［3］。更有研究表明在人早期胚肝内CD20定位于细胞核内，而细胞膜和细胞质呈阴性，但其具体的作用机制仍有待阐明［4］。

CD20在脑梗死患者外周血淋巴细胞中的表达有明显的升高，而且其表达越高，神经功能缺损越重，提示CD20参与了脑梗死后的炎症和免疫反应［5］。CD20是否在脑梗死病灶及缺血半暗带中表达未见有报道，通过免疫组织化学的方法发现CD20在脑梗死病灶及缺血半暗带中表达显示出明显的特征。在梗死灶和缺血半暗带以外的未缺血脑组织中未见到有CD20的表达，在缺血半暗带与正常脑组织之间有明显的分界线；缺血3 h未见到有CD20的表达；缺血6 h发现有CD20的轻度表达，且多数表现为神经细胞膜表达，少数表现为神经细胞胞浆的表达；缺血24 h CD20强烈表达于神经细胞胞浆。根据CD20在缺血后脑组织表达的时空变化特征，推测CD20在缺血6 h左右开始表达，并且初期表达于神经细胞的胞膜，随着缺血的持续和加重，进一步表现为胞浆表达。脑缺血后迟发性神经细胞坏死发生于缺血后6 h～8 h，其主要的作用机制就是由于缺血过度诱导的细胞凋亡［6］。CD20在脑缺血后的表达处于发生细胞凋亡发生的时期，因此神经细胞CD20表达的作用机制可能与钙超载和细胞凋亡有关。

［1］ Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20：84－91.

［2］ 洪海燕，舒翠玲，郭燕翔，等.人CD20胞外区基因在原核系统中的表达［J］.免疫学杂志，2000，116（3）：172－174.

［3］ Deans JP，Li H，Polyak MJ.CD20－mediated apoptosis：Signaling through lipid rafts［J］.Immunology，2002，107（2）：176－182.

［4］ 刘影，唐军民，唐岩，等.人早期胚胎中CD20阳性细胞的免疫组织化学定位［J］.解剖学报，2007，38（2）：238－240.

［5］ 夏光明，郑雅文，李钢，等.急性脑梗死患者外周血B淋巴细胞CD19、CD20表达的临床研究［J］.中国伤残医学杂志，2008，16（2）：18－19.

［6］ Arvin KL，Han BH，Du Y，etal.Minocycline markedly protects the neonatal brain against hypoxic－ischemic injury ［J］.Ann Neurol，2002，52（1）：54－61.