应用实时荧光定量PCR检测血清miR-122和miR-22及其在慢性乙型肝炎患者中的表达

姜跃炜 叶 瑾 朱小区



应用实时荧光定量PCR检测血清miR-122和miR-22及其在慢性乙型肝炎患者中的表达

姜跃炜 叶 瑾 朱小区

目的 建立血清中microRNA(miRNA)的实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的检测方法，对慢性乙型肝炎患者血清中miR-122和miR-22的表达水平进行检测和分析，探讨其在慢性乙型肝炎患者血清中表达的意义。方法 茎环引物用于成熟型miRNA反转录，以建立SYBR Green Ⅰ PCR筛选和定量检测miRNA的方法。同时，采用10倍梯度稀释的miR-122标准品cDNA(1～109拷贝/微升)评价其敏感度；采用熔解曲线评价其检测miRNA的特异性；通过对2×105、2×106、2×107拷贝/微升的miR-122标准品cDNA分别进行批内20次重复实验，以其循环阈值(Ct)的变异系数(CV)评价其精密度。采用建立的qRT-PCR技术检测慢性乙型肝炎患者及正常人血清中miR-122和miR-22的表达水平。结果 建立了茎环引物的RT-PCR法检测血清中的miRNA，该方法的线性范围宽，敏感度高，重复性好，方法简便。在慢性乙型肝炎患者组中血清miR-122和miR-22的相对表达量分别为17.88和5.35；与正常对照组中血清miR-122和miR-22的相对表达量(分别为1.80和1.67)比较，差异有统计学意义(P均=0.000)。结论 建立了茎环引物RT-PCR实时荧光定量PCR方法检测血清中的miR-122和miR-22，血清miR-122和miR-22在慢性乙型肝炎患者的血清中表达显著升高。

miR-122 miR-22 慢性乙型肝炎

我国乙型肝炎病毒表面抗原携带者占全国人口的7.18%[1]。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是引起慢性肝炎、肝硬化和肝癌的最主要原因。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类高度保守、长度20～24 个核苷酸的非编码单链小RNA，miRNA是一类在血清中稳定存在的短小核苷酸，已有报道证实miRNA可以作为肝脏损伤和妊娠的非常敏感的分子标志物[2,3]。 miR-122是肝细胞内特异高表达的miRNA。既往研究表明由miR-122, miR-22等11个miRNA组成的表达谱能预测干扰素治疗慢性乙型肝炎患者的疗效。但是检测乙型肝炎患者血清中的miRNA尚缺乏商品化的试剂盒，笔者利用茎环引物优化试验方法，建立SYBR Green PCR定量检测miRNA，同时初步评价其检测性能。并利用建立的方法检测血清miR-122和miR-22在慢性乙型肝炎患者的血清中表达的意义。

材料与方法

1.研究对象：按照2010年中华医学会肝病学分会，中华医学会感染病分会制订的《慢性乙型肝炎防治指南》[4]标准，筛检来自温州市中医院2010年1月～2012年12月HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者43例为研究对象，除外其他病毒重叠感染。其中男性36例(83.72%)，女性7例(16.28%)，患者平均年龄29.31±5.58(19～41)岁。正常对照者40例，为笔者医院保健科体检结果正常的人群。其中，男性32例，女性8例，患者年龄26.22±6.23(20～44)岁。两组年龄和性别差异无统计学意义(P>0.05)。

2.试剂及仪器:miRNA提取试剂(北京天根)；CDNA第1链合成试剂(美国Thermo)；SYBR GreenⅠ荧光定量PCR试剂盒(日本TaRaKa)；ABI 7900HT Fast real-time 荧光定量PCR仪(美国ABI公司)。

3.实验方法:(1)标本采集与处理:采集标本后2h 内用离心机离心12000g，4℃，15min，取上清，-80℃冻存。(2)血清miRNA富集部分的提取：用离心柱法提取血清miRNA富集部分。(3)合成cDNA：采用美国Thermo公司生产的Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，反应条件为：25℃ 5min；42℃ 60min；70℃ 5min 反应结束后，扩增好的cDNA模板用DNase-Free ddH2O稀释10倍作为定量PCR的模板。(4)miRNA 的荧光定量检测：采用TaRaKa 公司生产的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR试剂盒进行real-timePCR 检测，所有反应采用2复孔。20μl的反应体系：2μl的cDNA，10μl的SYBR Green Ex Taq，3.6μl的RNase -free water，2μl的PCR Forward Prime, 2μl的PCR reverse prime,0.4μl的ROX Reference DyeⅡ，miR-122、miR-22及U6引物由苏州金唯智公司合成，miR-122 引物序列为5′-TGGAGTGTGACAATGGTGTTTG-3′,miR-22 引物序列为5′-AAGCTGCCAGTTGAAGAACTGT-3′,U6引物序列为5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′为：95℃30s，接着95℃5s，60℃34s，40 个循环。采用ABI 7900实时定量PCR仪进行检测。(5)实验结果数据处理:检测miRNA的相对表达定量时，以U6作为内参基因,采用2-ΔΔCt法进行结果分析。以不同样本的相对表达定量值进行比较。以Fold=2-ΔΔCt表示待测组血清中miR-22和miR-122相对于对照组中表达水平的表达倍数。其中ΔΔCt=待测标本的ΔCt-对照样本ΔCt，ΔCt=目的基因Ct值-内参基因Ct值。

结 果

图1 qRT-PCR检测血清miRNA的条件优化1μmol/L浓度的茎环引物使PCR起跳点最明显，荧光值变化最显著；2μmol/L以上引物浓度使PCR基线增高，荧光曲线扁平，PCR扩增检测效率减弱

图2 miR-122扩增曲线图及熔解曲线图

图3 miR-22扩增曲线图及熔解曲线图

图4 将109拷贝/毫升 miR-122 cDNA标本稀释后进行检测从左至右为108、107、106、105、104、103拷贝/毫升 miR-122 cDNA扩增结果，仅在103拷贝/毫升时出现偏差

图5 茎环引物RT-PCR法检测miR-122的线性方程

2.在慢性乙型肝炎患者组中和正常对照组中血清miR-122和miR-22的表达：在所有的慢性乙型肝炎患者和正常对照则者中，血清miR-122和miR-22都被检测到。以U6为内参，慢性乙型肝炎患者组中的血清miR-122和miR-22的相对表达量(Fold=2-ΔΔCt)都比正常对照组显著升高，采用Mann-WhitneyU检验，两者比较差异均有统计学意义(P均<0.001，表1，图6)。

表1 两组血清miR-122和miR-22的表达比较 M[(P25～P75)]

与正常对照组比较,P均<0.001

图6 慢性乙型肝炎患者组和正常对照组中血清miR-122、miR-22的表达比较

讨 论

研究表明一定数量的循环miRNA可作为癌症检测或药物引起的肝损伤的一个稳定的标志物。作为起源于组织的在血清中的循环miRNA是复杂的[3]。肝脏损伤是由宿主免疫攻击引起的，可能有助于乙型肝炎患者血清中miRNA的产生。Zhang等[5]在对慢性HBV感染者血清中的miRNA表达研究中发现，miR-122可作为不同肝损伤的标志物，并且具有良好的敏感度和特异性。Zhang等[6]通过94例接受干扰素治疗的慢性乙型肝炎患者的血清样本做基因芯片分析，发现包括miR-22在内的11个血清miRNA表达谱能较好地预测干扰素治疗慢性乙型肝炎早期病毒学应答，有助于提高患者干扰素治疗的依从性和疗效。Hao等[7]发现IFN-α治疗能导致miR-122在肝细胞中表达减少。所以笔者选择了血清中miR-22和miR-122两个miRNA作为我们的研究对象。在笔者的研究中，建立了茎环引物的实时荧光定量PCR法检测血清中的miRNA。并进行了该方法的线性范围和敏感度评估实验与重复性实验，结果表明该方法线性范围宽，敏感度高，重复性好，方法简便。用RT-PCR法检测血清miR-122和miR-22的表达水平，慢性乙型肝炎患者组比正常对照组显著升高。提示这两个miRNA在HBV感染后表达上调。因此，血清中miR-122和miR-22的表达水平有可能作为乙型肝炎病毒感染的有效指标。

1 梁晓峰，陈园生，王晓军，等．中国3岁以上人群乙型肝炎血清流行病学研究[J]．中华流行病学杂志，2005,26(9)：655-658

2 Gilad S,Meiri E,Yogev Y,etal.Serum microRNAs are promising novel biomarkers[J]．PLoS One 2008,3(9):e3148

3 Wang K,Zhang S,Marzolf B,etal.Circulating microRNAs,potential biomarkers for drug-induced liver injury[J]．Proc Natl Acad Sci USA 2009,106(11):4402-4407

4 中华医学会肝病学分会，中华医学会感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)[J].中华临床感染病杂志,2011,4(1):1-13

5 Zhang Y, Jia Y, Zheng R,etal. Serum microRNA-122 as a biomarker for viral-, alcohol-, and chemical-related hepatic diseases[J]. Clin Chem，2010, 56(12): 1830-1838

6 Zhang X, Chen C, M Wu,etal.Serum microRNA profile as a predictor of early virological esponse to pegylated interferon treatment in chronic hepatitis B patients[J]. Antiviral Therapy, 2012,17(7): 1243-1253

7 Hao JL,Jin WS,Li XH,etal.Inhibition of alpha pegylated interferon(IFN-α)-induced microRNA-122 negatively affects the anti-hepatitis B virus efficiency of IFN-α[J].Journal of Virology，2013,87(1):137-146

(修回日期：2015-02-10)

Detection of Serum miR-122 and miR-22 in Patients with Chronic Hepatitis B by Using of a Quantitative Real-time PCR.

JiangYuewei,YeJin,ZhuXiaoqu.

TheTraditionalChineseMedicalHospitalofWenzhou,Zhejiang325000,China

Objective To establish a real-time quantitative PCR (RT-PCR) assay for detecting serum miR-122, miR-22, and evaluate the clinical significance of miR-122 and miR-22 in patients with chronic hepatitis B (CHB) by using of this assay. Methods The mature miRNAs were reversely transcripted by using of stem-loop primers. SYBR GreenⅠquantitative real-time PCR (qRT-PCR) was used for quantification of the miRNAs. The sensitivity of this assay was evaluated by using of the 10-fold-diluted miRNA-122 cDNA standards and the specificity was verified by using of melting curve assay. The accuracy was assessed by intra-assay coefficient of variation (CV) of threshold cycle (Ct value), which were calculated from a 20-times-repeat detection of the miR-122 cDNA (2×105, 2×106, 2×107copies/μl) standards. Using the established qRT-PCR assay, we detected the expression of serum miR-122 and miR-22 in the patients with CHB and healthy controls. Results The qRT-PCR assay exhibited good performances in the linear range, sensitivity and reproducibility while detecting miR-122 and miR-22. The relative level of miR-122 and miR-22 was 17.88 vs 5.35 in the CHB patients and 1.80 vs 1.67 in the controls (P=0.000). Conclusion Using of stem-loop primers, we established a qRT-PCR assay for detection of serum miR-122 and miR-22. Serum miR-122 and miR-22 increased significantly in the CHB patients.

miR-122;miR-22;Chronic hepatitis B

325000 温州市中医院检验科

R512

A DOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2015.10.034

2015-01-29)