嗜水气单胞菌胁迫下东北林蛙皮肤MyD88和TRAF6基因表达的动态变化

史雪灿，柴龙会，牛曙东，肖向红

（东北林业大学野生动物资源学院，黑龙江哈尔滨150040）

近年来，由于栖息环境的破坏、水源污染、微生物侵袭、疾病流行等因素，导致两栖动物的种群数量呈逐年下降趋势［1］。已有研究表明，嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila，Ah）作为一种普遍存在于两栖类中的条件性致病菌［2］，可引起蛙类出血性败血病（俗称“红腿病”），是影响其生存能力和种群数量下降的一个重要因素［3］。在微生物侵袭时，机体Toll样受体（toll－like receptors，TLRs）不仅可以识别病原相关分子模式（pathogen associated molecular pattern，PAMP）启动固有免疫应答，而且能激活信号通路调控适应性免疫应答。其信号通路中髓样分化因子（myeloid differentiation factor 88，MyD88）与肿瘤坏死因子受体相关因子6（TNF receptor associated factor 6，TRAF6）形成的复合物是多种信号向下游传递的共同途径，在启动多种TLR 和IL－1R信号转导途径、激活相关信号因子中起关键性作用［4］。东北林蛙（Rana dybowskii）作为我国重要经济动物，在药用、科研等方面具有重要价值。本试验以东北林蛙为试验对象，采用荧光定量PCR 技术检测东北林蛙被易感微生物嗜水气单胞菌注射后其皮肤MyD88和TRAF6mRNA 的差异表达，以期揭示东北林蛙在识别嗜水气单胞菌后，其机体TLR 信号通路中相关免疫分子的动态变化，探讨微生物侵袭时东北林蛙的TLR 信号调控机制，认识两栖类动物机体的免疫应答体系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物及菌株 东北林蛙，105只，雄性，2岁～3 岁，2013 年9 月 采 于 黑 龙 江 省 伊 春 地区。嗜水气单胞菌（1.1801）购自中国科学院微生物研究所，由东北林业大学动物生理实验室培养并冻存。

1.1.2 主 要 试 剂 TRIZOL○RReagent 为Life Technology公司产品；2×Taq Master Mix、50bp DNA Ladder、2.5×Real Master Mix、感受态细胞为天根生化科技有限公司产品；pMD18－T Easy vectors、样品保存液、Prime Script RT reagent Kit为宝生物工程（大连）有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 嗜水气单胞菌浓度的测定 挑嗜水气单胞菌的单菌落于LB 液 体 培 养 基 中，30 ℃，180r／min摇菌24h。每隔1h吸取部分菌液，测定其OD600 nm 值，描绘生长曲线。细菌计数，统计总细菌数。测定稀释度分别为0%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%时 菌 液 的OD600nm 值，计算试验所需的细菌浓度的培养时间。

1.2.2 总RNA 提取和RT－PCR 扩增 本试验分为试验组和对照组。试验组东北林蛙腹腔注射浓度为107CFU／mL的嗜水气单胞菌液1mL，注射后分别于0、2、6、12、24、48h时采集背部皮肤0.3g于离心管中，加样品保存液，于－80 ℃冰箱中保存。对照组注射等量的LB 培养基后按相同方法处理。按照TRIZOL○RReagent 说 明 书，提 取 蛙 皮 肤 总RNA，琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测其完整性和浓度。按照Prime Script RT reagent Kit说明书，对总RNA 进行反转录扩增。

1.2.3 PCR 和电泳检测 根据前期高通量测序所得东北林蛙基因序列，参照非洲爪蟾筛选出MyD88和TRAF6mRNA 序列，利用Primer 5.0设计β－actin、MyD88和TRAF6 mRNA 的上下游引物并进行合成（表1）。

表1 β－actin，MyD88和TRAF6的引物Table 1 The primers ofβ－actin，MyD88and TRAF6

按照2×Taq Master Mix说明书，以反转录试验所获cDNA 为模板进行PCR 试验。PCR 扩增获得所需片段，电泳检测其条带质量。电泳后回收DNA 片段，插入到pMD18－T 载体中并转化，经过培养进行阳性克隆筛选［5］。提取质粒进行测序分析。

1.2.4 实时荧光定量PCR 电泳后切胶回收目的基因，用紫外分光光度计测定回收片段的浓度及吸光度，将片段按10倍稀释成6个梯度，作为制作标准曲线的模板，绘制标准曲线。实时荧光定量PCR在CFX96TM Real－Time System（Bio－Rad Laboratories，Inc.）进行。反应按说明书进行如下设计：2.5×Real Master Mix 9μL，正向引物2μL，反向引物2μL，cDNA 模板1μL，加ddH2O 至最终体积20μL。每个反应重复3 次。反应条件为：94 ℃2 min；94 ℃30s，55 ℃（MyD88）或54 ℃（TRAF6）30s，72 ℃30s，40个循环；72 ℃5min。每1个周期在72 ℃延伸这一步骤时检测荧光值。

1.2.5 数据收集处理和分析 用CFX Manager软件（Bio－Rad Laboratories，Inc.）计算每个反应的平均拷贝数和对应的β－actin 的平均拷贝数，利用2－△△Ct法分析对照组和试验组MyD88 和TRAF6 mRNA 的相对表达量。采用SPSS（19.0）的独立样本T－test法检验不同样本之间表达量是否有显著性差异。

2 结果

2.1 嗜水气单胞菌培养与浓度测定

嗜水气单胞菌于LB 培养基中培养18 h，OD600nm 值为0.529，按1∶2 稀释，细菌计数为6.6×107CFU／mL。

2.2 总RNA 提取

通过紫外分光光度计检测所提取的样品组织总RNA 的OD 值，结果显示各样本OD260 nm／OD280nm 均在1.8～2.0。用15g／L 琼脂糖凝胶电泳检测总RNA 质量可见28S、18S、5SRNA 清晰条带（图1），说明样本无蛋白质污染，RNA 没有降解，质量符合试验要求，可以进行后续试验。

2.3 RT－PCR 扩增结果

用500ng总RNA 进行扩增试验，得到明亮清晰的条带（图2），条带长度与设计时引物片段大小相吻合，经测序显示条带与高通量测序结果一致。条带单一，无杂带、无引物二聚体及非特异性扩增，表明试验设计的特异性引物和所得反转录产物均满足后续荧光定量PCR 试验的要求。

图1 东北林蛙皮肤总RNA 电泳图Fig.1 Results of total RNA in skin of R.dybowskii

2.4 东北林蛙皮肤MyD88和TRAF6标准曲线的建立

软件CFX Manager输出标准曲线如下：

①MyD88的标准曲线：Slope＝－3.633y－int＝36.833，E＝88.5%，R2＝0.999（图3）。②TRAF6的标准曲线为：Slope＝－3.443y－int＝32.176，E＝95.2%，R2＝0.998（图4）。MyD88和TRAF6基因的标准曲线线性关系良好，相关系数和扩增效率都满足要求，可用于后续试验。

图2 RT－PCR扩增结果Fig.2 RT－PCR results

2.5 东北林蛙皮肤MyD88 和TRAF6 mRNA 的熔解曲线

皮肤MyD88和TRAF6mRNA 的熔解曲线上均只有一个明显的峰（图5、图6），其中MyD88 和TRAF6mRNA 的熔解温度分别为81.5 ℃和79.5℃。结果表明荧光定量PCR 中没有产生MyD88和TRAF6mRNA 的非特异性扩增及引物二聚体，试验中的荧光值均来自特异性的扩增产物。

图3 MyD88标准曲线Fig.3 Standard curve of MyD88

2.6 嗜水气单胞菌对东北林蛙皮肤MyD88 和TRAF6mRNA 表达量的影响

嗜水气单胞菌注射后，东北林蛙皮肤MyD88 mRNA 的表达量在2h降低了50%，6h至60%，12h达峰值为238%，24h又下降至125%，48h为122%。TRAF6 mRNA 表达量在2 h 升高至220%，6h至187%，12h达峰值为812%，24h又下降至432%，48h为254%。结果显示细菌注射后皮肤MyD88和TRAF6mRNA 的表达量与注射前相比呈显著性差异（P＜0.05），且在12h均呈现峰值，尤以TRAF6 mRNA 表达水平为最显著，在24 h～48h仍处于较高水平，说明嗜水气单胞菌激活了东北林蛙皮肤的TLR 信号通路并诱发了MyD88和TRAF6mRNA 的表达（图7）。

图4 TRAF6标准曲线Fig.4 Standard curve of TRAF6

图5 皮肤MyD88mRNA 的熔解曲线Fig.5 Melt peaks of MyD88mRNA in skin

图6 皮肤TRAF6mRNA 的熔解曲线Fig.6 Melt peaks of TRAF6mRNA in skin

图7 嗜水气单胞菌注射后东北林蛙皮肤MyD88和TRAF6mRNA 的表达量变化Fig.7 Real－time PCR analysis of MyD88and TRAF6mRNA expressions in skin following exposure to Ah

3 讨论

Toll样受体不仅是固有免疫应答中识别病原相关分子模式（PAMP）的主要受体，而且其激活的信号通路还能调控适应性免疫应答［6］。哺乳动物研究显示，MyD88是Toll受体信号转导途径中非常重要的衔接分子之一，也是多种TLR／IL－1信号途径向下游传递的关键分子［7］。在MyD88 介导的TLR 信号通路中，MyD88 活化后可诱导白介素－1受体相关激酶（interleukin－1receptor－associated kinases，IRAKs）磷酸化，进一步激活胞浆内TRAF6使之活化，最终激活细胞内的核转录因子kappa B（nuclear factor kappa－light－chain－enhancer of activated B cells，NF－κB）。胞浆中活化后的NF－κB 转移到细胞核内，引起多种促炎细胞因子的转录和表达，从而引发炎症反应［8－10］。

本试验结果显示，东北林蛙在注射嗜水气单胞菌后，MyD88和TRAF6mRNA 的表达量均发生明显变化，且均在12h呈现峰值。TRAF6mRNA 表达水平为最显著，在24h～48h仍维持较高水平。说明注射嗜水气单胞菌后，东北林蛙皮肤的TLRs信号通路被激活，MyD88和TRAF6mRNA 的表达量上升，东北林蛙体内存在MyD88－TRAF6这一通路，在微生物入侵时，这一通路被激活，参与东北林蛙机体的早期免疫应答并发挥作用。对哺乳动物的研究表明，MyD88不仅在TLR 信号途径中发挥着关键的作用，还通过影响相关细胞因子的分泌来参与多种免疫应答［11］，在抗感染免疫、传递上游信息、连接下游信号和疾病免疫应答中具有重要的作用［12－13］。在MyD88依赖的信号通路中，TRAF6是必需的连接分子。MyD88 与TRAF6 形成的复合物，在启动多种TLR 和IL－1R 信号转导途径、激活相关信号因子中起关键性作用［14］，是多种信号向下游传递的共同途径。这与本研究中MyD88 与TRAF6mRNA 表达共同出现峰值的结果相吻合。O′Neill发现，TRAF6是免疫过程中的关键信号分子，不仅参与TLR／IL－1天然免疫和适应性免疫，且对IL－1、LPS 等促炎因子的应答起着重要作用［15－16］。本试验中嗜水气单胞菌被注射到东北林蛙24h 后，MyD88 mRNA 的表达量回落明显，而TRAF6mRNA 表现出432%的表达量。由此推测，在TLR 信号通路启动后，TRAF6 被大量激活并长时间的发挥效应。但究竟是MyD88直接激活TRAF6来发挥作用，还是MyD88和TRAF6的表达激活下游效应因子而产生效应，尚需进一步研究。

本试验对东北林蛙TLR 信号通路进行了初步研究。结果表明，东北林蛙在识别嗜水气单胞菌后，其机体TLR 信号通路中的相关免疫分子MyD88和TRAF6均发生了显著性差异，说明TLR 信号通路在蛙类的抗细菌感染中发挥重要作用，是先天免疫系统的重要组成部分，也是蛙类在水生环境中生存的重要保护屏障。

［1］ Simon S N，Chancon J S，Cox N A，et al.Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide［J］.Science，2004，6：1783－1786.

［2］ Pan T，Ren S，Xu M，et al.Extractive biodecolorization of triphenylmethane dyes in cloud point system by Aeromonas hydrophila DN322p［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2013，97（13）：6051－6055.

［3］ Zhang D H，Pridgeon J W，Klesius P H.Expression and activity of recombinant proaerolysin derived fromAeromonas hydrophila cultured from diseased channel catfish［J］.Vet Microbiol，2013，165（3－4）：478－482.

［4］ Tang D，Gao Y H.Characterization，genomic organization，and expression profiles of MyD88，a key adaptor molecule in the TLR signaling pathways in miiuy croaker（Miichthys miiuy）［J］.Fish Physiol Biochem，2012，38：1667－1677.

［5］ Sambrook J，Russell D W.分子克隆实验指南［M］.黄培堂译.北京：科学出版社，2002.

［6］ 马思慧，杨 欢，吴天成，等.Toll样受体信号传导通路的研究进展［J］.中国畜牧兽医，2014，4（8）：160－164.

［7］ Van der Vaart M，Van Soest JJ，Spaink HP，et al.Functional analysis of a zebrafish myd88 mutant identifies key transcriptional components of the innate immune system［J］.Dis Mode Mecha，2013，6（3）：841－54.

［8］ 高 明，敖 越，栾新红.Toll样受体信号转导的负调控机制研究进展［J］.动物医学进展，2015，36（1）：96－101.

［9］ Zhao W，Wang L，Zhang M，et al.E3ubiquitin ligase tripartite motif 38negatively regulates TLR－mediated immune responses by proteasomal degradation of TNF receptor－associated factor 6in macrophages［J］.J Immunol，2012，188（6）：2567－74.

［10］ Xie Y F，Cui Y B，Hui X W，et al.Interaction of IFNλR1with TRAF6regulates NF－κB activation and IFNλR1stability［J］.J Cell Biochem，2012，113（11）：3371－3379.

［11］ 吴燕燕，王 易.Toll样受体信号通路中MyD88的研究进展［J］.免疫学杂志，2012，28（3）：262－265.

［12］ Wang X，Ha T，Zou J，et al.MicroRNA－125bprotects against myocardial ischaemia／reperfusion injury via targeting p53－mediated apoptotic signalling and TRAF6［J］.Cardiovasc Res，2014，102（3）：385－95.

［13］ Khan S，Choi RJ，Shehzad O，et al.Molecular mechanism of capillarisin－mediated inhibition of MyD88／TIRAP inflammatory signaling in in vitro and in vivo experimental models［J］.J Ethnopharmacol，2013，145（2）：626－37.

［14］ Zhang W，He T，Wang Q，et al.Interleukin－1receptorassociated kinase－2genetic variant rs708035increases NF－κB activity through promoting TRAF6ubiquitination［J］.J Biol Chem，2014，289（18）：12507－19.

［15］ O′Neill L A.The interleukin－1receptor／Toll like receptor super family：10years of progress［J］.Immunol Rev，2008，226：10－18.

［16］ Qiu L，L Song，Y Yu，et al.Identification and expression of TRAF6（TNF receptor－associated factor 6）gene in Zhikong scallop Chlamys farreri［J］.Fish Shellfish Immunol，2009，26（3）：359－367.