H4亚型禽流感病毒套式RT－PCR 检测方法的建立

吴嫒琼，谢芝勋，胡庭俊＊，谢丽基，罗思思，邓显文，谢志勤，黄 莉，黄娇玲，曾婷婷

（1.广西大学动物科学技术学院，广西南宁530004；2.广西兽医研究所畜禽疫苗新技术重点实验室，广西南宁530001）

禽流感（Avian influenza，AI）是由正黏病毒科A 型流感病毒属的禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）引起的一种禽类的感染／疾病综合征，主要引起禽类的全身或呼吸系统疾病［1］。AIV亚型众多，根据表面糖蛋白血凝素（hemagglutinin，HA）和神经氨酸酶（neuraminidase，NA）的抗原性差异，已鉴别出16 种HA 亚型（H1－H16）和9 种NA（N1－N9）亚型［1］；根据AIV 致病力的差异可分为高致病性禽流感病毒（Highly pathogenic avian influenza virus，HP－AIV）和低致病性禽流感病毒（Lowly pathogenic avian influenza virus，LP－AIV）［2］。HP－AIV 引起的家禽AI以全身感染、高发病率和高死亡率为特征。LP－AIV 引起的家禽AI临床症状表现温和，病死率不高，但影响家禽的生长发育和生产性能。

H4亚型AIV 属于LP－AIV，能隐性感染各种家禽及野生鸟类［3］，宿主范围比较广，包括鸡、火鸡、鸭、野鸭、野鸟、鸵鸟、鹦鹉等，还可以跨物种传播，感染哺乳动物［4］。薛峰等［5］报道，在江苏盐城国家级自然保护区对野鸭、丹顶鹤等野禽AIV 检测中，H4亚型AIV 分离率最高（38.5%）。虽然绝大多数LP－AIV 致病力低，但LP－AIV 可能为感染人类的AIV 提供基因［6］，潜在危害性不容忽视。因此，应加强对H4亚型AIV 的监测。

目前，国内建立的AIV 快速检测方法多数都是针 对 其 他 亚 型AIV，如H1、H3、H5、H6、H7、H9［7－11］亚型，而针对H4亚型AIV 的快速检测方法未见报道。所以，本研究建立的H4亚型AIV 的套式RT－PCR 方法，旨在为H4亚型AIV 的临床监测提供有效的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 5株H4亚型AIV、其他AIV 亚型（H1、H3、H6、H9）、传染性支气管炎病毒（IBV）、新城疫病毒（NDV）、传染性喉气管炎病毒（ILTV）、禽呼肠病毒（ARV）及鸡毒支原体（MG）由广西兽医研究所生物技术实验室保存；H5、H7亚型AIV RNA由美国宾夕法尼亚州立大学惠赠。

1.1.2 主要试剂 SPF 鸡胚为北京梅里亚公司产品；DNA／RNA 试剂盒为北京全式金生物技术有限公司产品；RNA 反转录试剂、dNTP 和2×Taq PCR Mix为宝生物工程（大连）有限公司产品。

1.1.3 引物设计与合成 根据H4 亚型AIV 的HA 基因核苷酸序列的保守区域，应用生物学软件Primer Premier 5.0 设 计 并 筛 选 了2 对 特 异 性 引物，即外引物和内引物（表1）。其中，外引物扩增目的片段为342bp，内引物扩增目的片段为199bp。引物由Invitrogen公司合成。

表1 外引物和内引物序列Table 1 The sequence of inner and outer primers

1.1.4 病毒 RNA 的抽提与反转录 参照DNA／RNA 抽提试剂盒使用说明书抽提病毒RNA 和ILTV 及MG DNA，用随机引物将RNA 反转录成cDNA，置于－30 ℃保存备用。

1.2 方法

1.2.1 套式RT－PCR条件的优化 2次PCR 均为25μL反应体系，其他体系组分不变（2×PCR Master Mix 12.5μL、模板2μL），分别针对引物浓度、反应循环数及退火温度进行优化。第1轮PCR 扩增，外 引 物 上、下 游 引 物 各0.1 μL ～0.5 μL（25.0pmol／μL）范围，循环数15、18、21、25、30.5个梯度，退火温度50℃～60℃优化反应体系。第2轮PCR 以第1轮PCR 产物10倍倍比稀释物为模板，优化第2轮PCR 反应模板浓度，引物浓度、反应循环数及退火温度优化同第1轮。

1.2.2 特异性试验 用本研究建立的套式RTPCR 方法，同时扩增H1、H3、H4、H5、H6、H7、H9亚型AIV、NDV、IBV、ILTV、MG 和ARV 的核酸，以超纯水作为阴性对照，将PCR 产物经15g／L 琼脂糖凝胶电泳，观察结果。

1.2.3 敏感性试验 测定H4亚型AIV RNA 的浓度，并按10倍倍比稀释H4亚型AIV RNA，其浓度分别为3.6ng／μL、360、36.0、3.60pg／μL、360、36.0、3.6fg／μL。对各浓度的病毒RNA 进行反转录后，分别进行普通RT－PCR 和套式RT－PCR 扩增，并设阴性对照，PCR 产物经15g／L琼脂糖凝胶电泳，观测结果。

1.2.4 临床样品检测 将106份从广西南宁市活禽市场采集的口腔和泄殖腔拭子进行RNA 提取，反转录为cDNA，应用本试验建立优化好的套式RT－PCR 方法进行扩增，重复3次，保证试验的准确性。对106份样品进行抗生素处理，用鸡胚分离病毒，用传统的病毒血清学检测方法进行鉴定。

2 结果

2.1 套式RT－PCR条件优化结果

本试验经过对套式RT－PCR 条件的优化，最后确定最佳的反应条件为：两轮的反应体系都是25μL，2×Taq PCR Mix 12.5μL，2μL cDNA，引物 上、下 游 各0.2 μL（25 pmol／μL），加 纯 水 至25μL。第1 轮 反 应 模 式 为：95 ℃5 min；95 ℃50s，55 ℃40s，72 ℃1 min，21 个 循 环；72 ℃10min，12 ℃结束反应。第2轮反应模式为：95 ℃5min；95 ℃50s，56 ℃40s，72 ℃1min，21个循环；然后进入72℃延伸10min，12℃结束反应。将PCR 产物经15g／L琼脂糖凝胶电泳，结果表明，第1轮特异性扩增产物大小为342bp，与预期结果相符；第2轮特异性扩增产物大小为199bp，与预期结果相符（图1）。

2.2 特异性试验结果

将各病原体待检测的cDNA 进行套式RTPCR 特异性扩增后，扩增产物经琼脂糖凝胶电脉结果表明只在H4亚型AIV 的cDNA 处出现了大小199bp的目的条带，其他病原体的cDNA 与阴性对照都无条带出现（图2）。说明本试验建立的套式RT－PCR 检测方法具有良好的特异性。

2.3 敏感性试验结果

结果表明，普通RT－PCR 最低能检测到36pg／μL的病毒含量（图3）。而套式RT－PCR最低能检测到360fg／μL的病毒含量（图4）。经比较，套式RT－PCR比普通RT－PCR 灵敏性高100倍。

2.4 临床样品检测结果

在广西南宁市活禽市场106 份样品中，套式RT－PCR 检测结果有3份呈H4亚型AIV 阳性（图5）；病毒分离鉴定结果为3份阳性样品。表明所建立的套式RT－PCR 检测结果与病毒分离鉴定结果一致。

图1 套式RT－PCR 优化结果Fig.1 The optimization results of nested RT－PCR

图2 套式RT－PCR 特异性试验结果Fig.2 The specificity assay of nested RT－PCR

图3 常规RT－PCR 的敏感性试验结果Fig.3 The sensitivity assay of conventional RT－PCR

图4 套式RT－PCR 的敏感性试验结果Fig.4 The sensitivity assay of nested RT－PCR

图5 套式RT－PCR的临床样品检测结果Fig.5 The detection results of clinical samples by nested RT－PCR

3 讨论

AIV 是一种高度接触性、急性传染病，可引起感染家禽从呼吸系统病变到全身败血的症状。自首次发现AIV 以来的100 多年里，世界各地不断有AI的暴发和流行，给养禽业造成了巨大的经济损失。H4亚型AIV 属于低致病禽流感病毒，多从水禽和野鸟体内分离到，在鸭、鹅和野鸟等体内持续存在，且可能传播给鸡［12］。并且，H4亚型AIV 广泛分布于世界各地，许多国家都分离到H4亚型AIV，在中国也分离到了H4亚型AIV。因此，加强对H4亚型AIV 检测和鉴别具有很重要的意义。

本研究通过H4亚型AIV HA 基因比对分析，设计并筛选了2对特异性引物，针对H4 亚型AIV模板进行两轮PCR 扩增，通过对反应体系和条件的优化，建立了H4亚型AIV 套式RT－PCR 方法。用本研究所建立的套式RT－PCR 方法，对H1、H3、H4、H5、H6、H7、H9 亚型AIV、NDV、IBV、ILTV、MG 和ARV 的 核 酸 进 行 扩 增，结 果 该RT－PCR 方法只能扩增H4亚型AIV，而对其他亚型AIV 及禽呼吸道疾病病原体不扩增，表明该PCR 方法具有高度特异性；用本研究所建立的套式RT－PCR 方法和常规RT－PCR 方法分别进行敏感性试验，结果套式RT－PCR 方法较常规RT－PCR 方法更敏感。对活禽市场106份样品分别用本研究建立的套式RT－PCR方法进检测和传统的病毒血清学检测方法进行鉴定，两者结果一致。综上所述，本研究建立的套式RT－PCR 方法特异性强、敏感性好、精确度高，为监测H4亚型AIV 提供了有效的检测方法。

套式RT－PCR 是在常规RT－PCR 技术基础上发展和改良而来的。常规RT－PCR 是通过1对引物进行特异性扩增，套式RT－PCR 比常规RT－PCR 增加了1对引物，这对引物结合在第1次PCR 扩增产物的内部，通过两轮扩增，建立套式RT－PCR检测方法。与常规RT－PCR 相比，套式RT－PCR 具有以下两方面的优势：①当样品模板量低时，常规RT－PCR可能检测不到样品，套式RT－PCR 通过第2轮在第1轮PCR 产物内部进一步扩增，可增加检测的敏感性，提高检测的准确性，避免漏检阳性样品。经过本研究敏感性试验的验证，表明所建立的套式RTPCR 比常规RT－PCR 敏感性高出100倍；②客观来说，一对引物不是万能的，当非特异性扩增不能完全避免的时候，如第1轮扩增产生了非特异性片段，第2轮不能在第1轮PCR 产物上继续进行扩增，提高了套式RT－PCR的特异性。值得注意的是，由于第2轮PCR 扩增的模板是第1轮的扩增产物，最好对第1轮产物进行稀释，避免第1轮的引物残留，影响第2轮扩增，因此，本研究经过对其优化，确定第1轮的产物需稀释100倍后作为第2轮的模板，达到了很好的PCR 扩增效果。此外，在套式RT－PCR 操作过程中，应注意防止模板和扩增产物污染，因而模板加入、扩增产物稀释和PCR 反应体系配制（包括第1轮和第2轮）应分区域进行，并加入阴性对照进行比较，从而保证试验的精确性。虽然套式RTPCR 需进行2 次PCR 反应，但每次的反应时间相比，较于普通RT－PCR均缩短了1倍左右，总体反应时间与普通RT－PCR 相同，但套式RT－PCR 方法特异性更强、敏感性更好、精确性更高。

本研究建立的H4 亚型AIV 套式RT－PCR 方法具有精确性高、特异性好、灵敏度高等特点，为H4亚型AIV 的快速检测提供了方法，对有效防控H4亚型AIV 有重要意义，为AIV 的监测和快速诊断提供了方法，具有良好的应用前景。

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