山东沂源硬蜱携带无形体的调查及进化分析

刘相叶，武志强，刘转转，汤仁仙，颜 超，郑葵阳＊

（1.徐州医学院病原生物学与免疫教研室，感染与免疫实验室，江苏徐州221004；2.Department of Biology，Colorado State University，Fort Collins，Colorado，80523，USA）

人粒细胞无形体病（Human granulocytic anaplasmosis，HGA）是一种严重威胁人类健康的新发人兽共患病，其病原体为嗜吞噬细胞无形体（Anaplasma phagocytophilum），是一种细胞内专性寄生的革兰阴性菌，属立克次体目（Rickettsiales）无形体科（Anaplasmataceae）无形体属（Anaplasmas），可以感染人、啮齿动物和反刍动物等多种哺乳动物［1－3］。硬蜱是介导嗜吞噬细胞无形体在人、家畜和野生动物之间循环传播的主要媒介，我国分布广泛的全沟硬蜱、森林革蜱、长角血蜱等均被视为嗜吞噬细胞无形体的传播媒介［4］。血清学调查发现，我国HGA的流行呈现农村高于城市的趋势（农村为15.4%，城市为1.5%）［5］，这可能与嗜吞噬细胞无形体在家畜和硬蜱体内的高感染率有关（山羊26.69%、牛23.38%、长角血蜱43.5%）［6－7］。

山东省沂源县地处鲁中腹地，自2004年以来，不断有当地农民确诊HGA 的报告；血清学调查显示，这些农民HGA 抗体阳性率是全国平均水平的2倍［5，8］。该地区农民除作物耕种以外，多从事山羊养殖。每年春夏季节的蜱虫活跃期，山羊体表有大量的硬蜱寄生，并且时有蜱咬人事件的发生。为了解这一地区硬蜱感染嗜吞噬细胞无形体的情况，本课题组于2015年5月～7月的硬蜱活跃期，以家养或野外放养山羊为对象，采集寄生于山羊体表的硬蜱。采用套式PCR 扩增嗜吞噬细胞无形体的16SrRNA基因片段并测序，鉴定蜱虫嗜吞噬细胞无形体并分析其16SrRNA 基因的变异情况，为当地HGA 的预防提供参考意见。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 调查地点 沂源县位于山东省中部，是淄博、莱芜、临沂、潍坊四市的结合部，地理坐标：东经117°54′～118°31′，北纬35°55′～36°23′之间，属温带季风区域大陆性气候。

1.1.2 样本采集 本次调查选取有疑似HGA 病例的自然村开展硬蜱调查，采用体表视检法采集不同地区家养或野外放牧山羊体表寄生的硬蜱。采集的硬蜱保存在通气干燥的细胞培养瓶内，12h内带回实验室进行分类鉴定和病原检测。

1.1.3 主要试剂 DNA 提取试剂盒，德国QIAGEN 公司产品；Taq DNA 聚合酶、10×PCR 缓冲液、dNTP混合物，宝生物工程（大连）有限公司产品；无水乙醇，国药集团化学试剂有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 根据文献报道［7，9］，合成无形体16SrRNA 基因内外引物各一对，蜱虫16SrRNA基因引物一对；引物名称及序列见表1。所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，用灭菌去离子水稀释至100μmol／L分装，置－20℃保存备用。

表1 PCR 引物Table 1 The primers for PCR

1.2.2 样本DNA 的提取 采集的硬蜱样本分类鉴定后分组，若蜱每组3只～4只，成蜱每组1只。每组单独放在含有750mL／L 酒精的EP 管内浸泡30min，再用灭菌去离子水洗涤3次，晾干。分别置于含有200μL 1×PBS 的研磨管内，在快速样品均质器上室温条件下均质，均质程序为：6m／s运行40 s，暂停300s，共2个循环。稍离心后，取180μL 均质液，置于灭菌EP管内，按照DNA 提取试剂盒说明提取样本DNA。按同样操作提取无菌水作阴性对照。

1.2.3 PCR 扩增 无形体16SrRNA 基因的扩增采用套式PCR，第一轮扩增使用通用引物EH－out1和EH－out2，25μL 反应体系成分如下：1.2.2中提取的DNA 1μL 为模板，加入相应的上、下游引物（10μmol／L）各1 μL，Ex Taq DNA 聚 合 酶（5 U／μL）0.1 μL，10×PCR 缓 冲 液（20 mmol／L Mg2＋Plus）2.5μL和dNTP 混合物（2.5mmol／L）2.0μL，补去离子灭菌水到25μL，瞬时离心混匀。反应程序如下：94℃预变性5 min；94℃45s，55℃50s，72℃1min，40个循环；72℃延伸5min。第2轮反应以1μL第一轮产物为模板，扩增使用特异性引物HGA1和HGA2，反应体系和反应条件同第一轮，扩增片段预期大小为389bp。取10μL 扩增产物通过10g／L的琼脂糖电泳，观察结果。

1.2.4 序列分析 无形体16SrRNA 基因片段的PCR 产物经核酸电泳鉴定大小正确后，送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，测序结果提交GenBank并进行16SrRNA 基因序列核苷酸同源性比较和查询，并采用ClustalX2.0进行多序列的排列和进化软件MrBaye3.2.5 绘制基因进化树［10］。

2 结果

2.1 调查地区概况

山东沂源县属中低山丘陵区，多山林、草地，农业人口占80%，当地农民多从事经济作物种植与畜牧养殖（以养殖波尔山羊、黑山羊及红山羊为主）。山羊主要以野外山林放养为主，体表寄生有大量硬蜱，虽做杀虫处理，但是效果不理想（图1）。人与家畜接触密切，常有蜱虫叮咬事件的发生。

图1 长角血蜱寄生于红山羊耳背面Fig.1 H.longicornis on the back of red goat

2.2 样本采集

本次调查从波尔山羊、黑山羊、红山羊体表共采集硬蜱923只，经形态学与蜱虫16SrRNA 扩增鉴定均为长角血蜱，随机选取其中126 只（包括成蜱43只、若蜱83只），分别提取其核酸后做嗜吞噬细胞无形体病原检测。

2.3 PCR 扩增

将126只硬蜱分为54组，分别提取DNA 进行套式PCR 扩增。26组产生389bp大小的预期片段（图2），扩增阳性率为48.1%。

2.4 序列分析

26份阳性扩增产物全部测序成功，将阳性序列（362bp）利用ClustalX2.0进行比对，按照100%相似性进行归类，结果共检出7类变异株（分别命名为YT1～YT7，GenBank 注 册 号 为 KT276559 ～KT276565），其中YT5 同其他序列存在显著差异（图3）。YT1占检出序列的11.5%（3／26）与2012年日本全沟硬蜱体内检出的嗜吞噬细胞无形体序列（JQ622148）的同源性达99%，并且与2007年山东沂源发热病人体内检出的无形体序列YYH3（EU982709）保持较近的进化关系（图4）；YT2占检出序列的50%（13／26）是本次所有检出变异株中的优势菌株，与2010年日本长角血蜱体内检出的牛无形体序列（EU181143）同源性达98%，同时与YT7保持密切的遗传关系（图4）；YT3 占检出序列的11.5%（3／26），与2010年我国湖北随州长角血蜱体内检出的嗜吞噬细胞无形体序列（HM641751）具有99%的同源性，遗传进化分析显示YT3与2007年山东沂源山羊体内检出的无形体序列YYS3（EU982704）遗传关系较近（图4）；YT4和YT6均占检出序列的0.4%（1／26）与2009年北京牛体内检出的嗜吞噬细胞无形体序列（GQ500018）同源性较高，并与2007年山东沂源长角血蜱体内检出的无形体序列（EU982710）保持密切的遗传关系（图4）。

图2 长角血蜱标本DNA 提取物PCR 扩增结果Fig.2 PCR results of 16SrRNA gene of Anaplasmain H.longicornis samples

图3 无形体16SrRNA 基因序列比对结果Fig.3 Multiple sequence alignment analysis of 16SrRNA gene of Anaplasma

图4 无形体16SrRNA 基因的遗传进化树Fig.4 Phylogenic tree of 16SrRNA gene of Anaplasma

3 讨论

嗜吞噬细胞无形体的主要传播媒介是硬蜱［11］。调查数据显示，在我国的全沟硬蜱、森林革蜱、长角血蜱等体内均可检测到嗜吞噬细胞无形体的16S rRNA 基 因 序 列［12－14］。山 东 省 沂 源 县 地 处 鲁 中 腹地，是淄博、莱芜、临沂、潍坊四市的交界处，家畜及野生动物流动较大。长角血蜱作为该地区的优势蜱种，大量寄生于家畜体表，给畜牧业生产造成了极大的危害；而且常有蜱咬人事件发生，给当地居民健康带来了严重威胁。本次调查结果显示，山东沂源长角血蜱体内嗜吞噬细胞无形体的阳性率为48.1%，明显高于2009年本地硬蜱体内17.6%的阳性检出率［8］，同时也高于山东莱州湾地区长角血蜱体内43.5%的阳性检出率［7］，说明该地区是人粒细胞无形体病的重要自然疫源地。

本次调查采用具有高度保守的嗜吞噬细胞无形体16SrRNA 基因作为分类和鉴定标准。54份长角血蜱标本中，26份扩增出嗜吞噬细胞无形体的16 S rRNA 基因，提示山东沂源地区山羊体表寄生的长角血蜱存在较高的无形体感染率，而山羊极有可能是该地区无形体病的重要储存宿主。将测序获得的16SrRNA 基因序列（362bp）进行比对分析发现，26份样本中存在7个嗜吞噬细胞无形体的变异株，但其中1株（YT5）与其他6株存在较大差异，可能是测序或克隆错误所致。其余5 株16SrRNA基因序列分别与中国湖北随州长角血蜱、北京牛、日本全沟硬蜱体内检出的嗜吞噬细胞无形体序列保持非常高的同源性，但相似性未达到100%，说明不同地方嗜吞噬细胞无形体会存在一定的变异。还有1株与日本长角血蜱体内检出的牛无形体同源性较高，可能是由于389bp 16SrRNA 基因的测序只能初步鉴定出嗜吞噬无形体感染的阳性样本，但是不能准确鉴定无形体属种型有关［15］。遗传进化分析显示，6个变异株均与2007 年山东沂源发热病人、山羊、长角血蜱体内检出的无形体保持非常密切的遗传进化关系，说明该地区嗜吞噬细胞无形体的不同变异株可能来自同一祖先，但是否是同一基因型，还需要进一步研究。

结合以往的HGA 现场流行病学与实验室调查［8，16］，本研究可以证实山东省沂源地区是重要的HGA 自然疫源地。值得我们注意的是，作为该病媒介的长角血蜱的嗜吞噬细胞无形体的携带率比2009年增长了1.7倍［8］，并且该地区出现了更多的变异株。山东沂源地区大部分山羊都由农民放养，山羊体表寄生有大量长角血蜱，农民和基层兽医与山羊都有着密切地接触，随时有被蜱虫叮咬的可能。所以有必要对当地农民、兽医加大蜱虫防控的宣传力度，防止HGA 发生大规模暴发。

［1］ Dumler J S，Choi K S，Garcia－Garcia J C，et al.Human granulocytic anaplasmosis and Anaplasma phagocytophilum［J］.Emerg Infect Dis，2005，11（12）：1828－1834.

［2］ 张 艳，宁长申.嗜吞噬细胞无形体对宿主细胞影响研究进展［J］.动物医学进展，2015，36（5）：95－98.

［3］ Severo M S，Stephens K D，Kotsyfakis M，et al.Anaplasma phagocytophilum：deceptively simple or simply deceptive？［J］.Future Microbiol，2012，7（6）：719－731.

［4］ Yu Z，Wang H，Wang T，et al.Tick－borne pathogens and the vector potential of ticks in China［J］.Parasite Vector，2015，8（1）：1－8.

［5］ Zhang L J，Liu H，Xu B L，et al.Rural residents in China are at increased risk of exposure to tick－borne pathogens Anaplasma phagocytophilum and Ehrlichia chaffeensis［J］.Biomed Res Int，2014：1－11.doi：10.1155／2014／313867.

［6］ Zhang L J，Liu H，Xu B L，et al.Anaplasma phagocytophilum infection in domestic animals in ten provinces／cities of China［J］.Am J Trop Med Hyg，2012，87（1）：185－189.

［7］ 于 强，刘庆辉，鞠中斌，等.山东莱洲湾湿地长角血蜱无形体16SrRNA 检测分析［J］.中国人兽共患病学报，2012，28（4）：323－326.

［8］ 张丽娟，崔 峰，王 玲，等.山东省沂源县无形体病实验室调查分析［J］.传染病信息，2009，22（1）：21－25.

［9］ Black W C，Piesman J.Phylogeny of hard－and soft－tick taxa（Acari：Ixodida）based on mitochondrial 16SrDNA sequences［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1994，91（21）：10034－10038.

［10］ Wu Z，Tembrock L R，Ge S.Are differences in genomic data sets due to true biological variants or errors in genome assembly：An example from two chloroplast genomes［J］.PLoS One，2015，10（2）：e0118019.

［11］ Woldehiwet Z.The natural history of Anaplasma phagocytophilum［J］.Vet Parasitol，2010，167（2－4）：108－122.

［12］ Cao W C，Zhao Q M，Zhang P H，et al.Prevalence of Anaplasma phagocytophila and Borrelia burgdorferi in Ixodes persulcatus ticks from northeastern China［J］.Am J Trop Med Hyg，2003，68（5）：547－550.

［13］ Yaxue Z，Hongtao J，Qiuyue W，et al.Molecular detection of Anaplasma phagocytophilum in ixodid ticks in Hebei province，China［J］.Vector－Borne Zoonot，2011，11（10）：1323－1327.

［14］ Zhang L，Wang G，Liu Q，et al.Molecular analysis of Anaplasma phagocytophilum isolated from patients with febrile diseases of unknown etiology in China［J］.PLoS One，2013，8（2）：e57155.

［15］ 陆群英，顾时平，柴程良，等.浙江西天目山部分动物感染无形体种属调查［J］.中华微生物学和免疫学杂志，2014，34（8）：589－593.

［16］ 崔 峰，王 玲，张 玲，等.山东省沂源县人粒细胞无形体病现场流行病学调查［J］.疾病监测，2009，24（6）：412－415.