氯化钙/甲酸溶解体系下丝素纳米纤维的制备及其性能

吴惠英， 周 燕， 左保齐

(1. 苏州经贸职业技术学院， 江苏 苏州 215009； 2. 苏州大学 纺织与服装工程学院， 江苏 苏州 215123；3. 现代丝绸国家工程实验室(苏州)， 江苏 苏州 215123)



氯化钙/甲酸溶解体系下丝素纳米纤维的制备及其性能

吴惠英1，2， 周 燕1， 左保齐2，3

(1. 苏州经贸职业技术学院， 江苏 苏州 215009； 2. 苏州大学 纺织与服装工程学院， 江苏 苏州 215123；3. 现代丝绸国家工程实验室(苏州)， 江苏 苏州 215123)

采用氯化钙/甲酸(FA)溶解体系溶解脱胶蚕丝形成丝素溶液，再将溶液干燥、去盐，将丝素膜在甲酸溶液中二次溶解获得丝素质量分数分别为4%、6%、8%的纺丝液。采用滚筒收集装置进行静电纺丝，讨论不同质量浓度丝素溶液的纺丝性能，通过SEM、红外以及体外降解等测试手段表征丝素纳米纤维的性能。结果表明：低质量分数(4%)纺丝液的黏度较低，会出现不连续液滴，高质量分数(8%)纺丝液所纺纤维直径较粗；实验所用丝素质量分数为6%的纺丝液纺成的纤维成形效果良好，直径主要集中在150～250 nm区域内。红外分析表明：经75%乙醇处理会促进丝素分子构象由α-螺旋向β-折叠的转变。降解实验表明，纤维在PBS溶液中降解60 d后质量损失15%，纤维粗细不均匀且发生黏连；在放线菌蛋白酶溶液中降解48 h后质量损失96.9%，纤维几乎完全降解，降解程度较PBS溶液中更明显。

氯化钙/甲酸； 丝素纳米纤维； 静电纺丝； 流变行为； 表面形貌； 红外光谱； 降解

随着国内外学者对蚕丝结构及性能的研究不断深入，蚕丝的应用逐渐从传统纺织领域向生物医用材料转变。再生丝素(SF)材料体现出良好的生物相容性、无污染、无刺激性及可降解性[1-2]，目前常被用来构建组织工程支架材料，如人工皮肤、人工肌腱、人工血管等[3]。静电纺丝法可制备与细胞外基质结构相似的纳米级纤维，纺丝装置简单，成本低，可操作性强，是目前制备纳米纤维最有效的方法之一[4-5]，而且纤维的成纤性及直径控制与溶液的浓度、黏度等因素有着密切关系。

本文采用氯化钙/甲酸(CaCl2-FA)溶解体系溶解脱胶蚕丝形成丝素溶液，再将溶液干燥、去盐，将干燥后的丝素膜二次溶解于甲酸溶液中获得丝素质量分数为4%、6%、8%的纺丝溶液。采用自制滚筒收集装置进行静电纺丝，讨论不同质量分数丝素溶液的纺丝性能。文中测试了纺丝液的流变性，通过SEM、红外光谱以及体外降解等测试手段表征CaCl2-FA溶解体系下丝素纳米纤维的表面形貌、二级结构以及体外降解性能。

1 实验部分

1.1 实验材料与测试仪器

蚕丝(浙江湖州)，碳酸钠(Na2CO3，上海试剂总厂)，氯化钙(CaCl2，上海试剂总厂)，甲酸(江苏强盛化工有限公司)，磷酸缓冲溶液(PBS)，放线菌蛋白酶(Actinomycetes Protease，Sigma公司)。

AR2000流变仪(美国TA公司)，Hitachi S-570场发射扫描电镜(日本，Hitachi Limited公司)，Nicolet 5700傅里叶红外光谱仪(美国Thermo Nicolet公司)；，DF-101S恒温加热磁力搅拌器(巩义市英峪予华仪器厂)。

1.2 CaCl2-FA溶解体系丝素纳米纤维制备

1.2.1 脱 胶

将天然桑蚕丝用质量分数为0.05%的Na2CO3溶液煮沸30 min，浴比为1∶20，脱胶后用60 ℃的去离子水反复清洗3次，然后置于60 ℃烘箱中烘干，备用。

1.2.2 丝素的溶解及静电纺丝

将脱胶桑蚕丝溶于质量分数为5.0%的CaCl2-FA溶液获得再生丝素溶液，将溶液干燥成膜后在去离子水中去盐24 h，并室温干燥得到再生丝素膜。将丝素膜二次溶解于甲酸溶液中获得丝素质量分数分别为4%、6%、8%的纺丝液进行静电纺丝。选用自制静电纺丝装置，以高速旋转的滚筒作为接收装置，如图1所示。装置主要由高压电源、计量泵、注射器、滚筒、电动机等组成。选用9号针头，纺丝流量为2 mL/h，滚筒转速为1 000 r/min，调整电压和距离，使场强达到1 kV/cm，制备微纳米纤维材料。后处理使用75%乙醇处理30 min，自然晾干，用于测试。

图1 自制静电纺丝装置示意图Fig.1 Schematic diagram of self-made electrospinning device

1.3 测试分析

1.3.1 丝素溶液的流变性分析

选用AR2000型流变仪，剪切速率控制在0.1～1 000 s-1，温度为(25±0.5)℃，测试再生丝素溶液的黏度。

1.3.2 形貌观察

采用Hitachi S-570扫描电镜观察静电纺丝素纳米纤维的表面形貌，喷金厚度为20～30 nm。

1.3.3 红外分析

采用美国NicoLet 5700型红外光谱仪测定静电纺丝素纳米纤维的分子结构，扫描次数为32次，波数范围为 4 000～500 cm-1，光谱分辨率为4 cm-1。

1.3.4 体外降解性研究

选用PBS溶液以及放线菌蛋白酶溶液对纤维进行体外降解实验。样品放入PBS溶液进行降解，每3 d取样，同时更换其他待测样品中的PBS溶液继续降解，PBS降解实验持续60 d。放线菌蛋白酶于37 ℃溶解于0.05 mol/L(pH=7.4)的PBS溶液中，得到5 unit/mL的放线菌蛋白酶溶液。降解过程中每隔2 h取出样品，同时用新配制的酶溶液更换原来的酶溶液，使其他的样品继续降解，酶溶液的体外降解实验持续48 h。取出的样品加入50 mL蒸馏水浸泡1 d，反复清洗，除去无机盐，室温干燥。将2种溶液降解后的纤维干燥后进行表面形貌观察。计算质量残留百分率D。

式中：D样品质量残留百分率；W0为降解前样品绝对干态质量；W1为降解后样品绝对干态质量。

2 结果与分析

2.1 流变性分析

流变性质对丝素溶液的成形加工及材料性能十分重要[6]。3种不同质量分数的丝素溶液的流变曲线如图2所示，随着丝素含量的不同，纺丝溶液的黏度有所差异，但基本表现为随剪切速率的增加黏度先递增后递减的趋势。剪切速度较低时，丝素溶液中的原纤结构彼此缠结明显，使溶液黏度增加；随剪切速度的逐渐增加，溶液中原纤结构的彼此缠结程度减弱，缠结点的更多拆除致使溶液的黏度值下降明显[7-9]。

图2 不同质量分数丝素溶液的流变曲线Fig.2 Rheological curves of SF solutions with different concentrations

2.2 纤维表面形貌观察

不同质量分数丝素溶液制得的静电纺丝素纳米纤维形貌如图3所示。由图可见丝素的质量分数为4%时，纤维直径较细，但会出现珠状物，纤维平均直径为(118±16) nm。低质量分数丝素溶液的黏度较低，在电场力作用下，有时会以不连续液滴形式进行喷射。同时溶剂挥发不完全，纤维网的杂乱程度明显，与传统接收屏收集的纤维排列情况相似。当丝素质量分数增至6%时，纤维直径分布主要集中在150～250 nm，纤维平均直径为(221±20) nm，离散程度小，同时纤维网的取向程度有了大幅度提高，这是因为纤维直径增大时，纤维的质量增大，在相同电场强度的作用下飞行速度较小，在这过程中牵伸作用处于主导地位。随丝素质量分数的继续增大至8%时，溶液黏度增加，丝素大分子链更易发生缠绕，在电场力作用下，溶液的较大表面张力使射流离开喷嘴后的分裂能力很难克服表面张力从而导致纤维直径增加[10-11]，纤维的平均直径达到(368.7±45) nm，离散程度大，取向程度变差。

图3 丝素纳米纤维的表面形貌Fig.3 SEM micrograph of SF nanofibers

图4 丝素纳米纤维的直径分布Fig.4 Distribution of SF nanofibers

丝素纳米纤维的直径分布如图4和表1所示。当丝素质量分数为4%时，纤维主要分布在50～250 nm间，直径主要集中在100～150 nm区域内，所占百分率为53%，而在200～250 nm区域内，所占百分率只有2%；当丝素的质量分数增至6%时，纤维直径主要分布在150～400 nm间，集中在150～250 nm区域内，所占百分率为74%，其中200～250 nm区域内，所占百分率达到36%；当丝素的质量分数增至8%时，纤维直径主要分布在250～550 nm间，集中在350～400 nm区域内，所占百分率为40%，且200～250 nm区域内直径分布为0。随丝素质量分数的不断增加，相应的纤维直径逐渐增大，向大直径方向移动。Yang等[12]验证了直径在250 nm的纤维有利于细胞生长，因此丝素质量分数为6%的纤维从直径上会更有利于细胞生长，适用于生物材料。

2.3 红外光谱分析

图6 丝素纳米纤维降解曲线Fig.6 Degradation curve of SF nanofibers. (a) PBS; (b) Actionmycetes protesa

未经乙醇处理的再生丝素材料是水溶性的，乙醇处理会改变材料的结构，不同质量分数纺丝液制备的丝素纳米纤维乙醇处理前后的红外光谱图如图5所示。由图可见，未经75%乙醇处理的纤维其主要吸收峰出现在1 651 cm-1(AmideⅠ)处，归属于α-螺旋[13]，在1 528 cm-1(AmideⅡ)处附近出现吸收峰，归属于β-折叠，但峰不尖锐。经过乙醇处理后，纤维的特征吸收峰在Amide I区发生了位置迁移，出现在1 628 cm-1处，归属于β-折叠，在Amide II区的吸收峰由1 528 cm-1迁移至1 519 cm-1，归属于β-折叠。相对未处理的样品来说，处理后的样品在Amide III区的1 231 cm-1处出现吸收峰，归属于β-折叠。特征峰的转变说明了乙醇处理后丝素分子构象的转变，即从α-螺旋构象到β-折叠的转变。

注：a、b、c曲线为处理前的；d、e、f曲线为处理后的。图5 丝素纳米纤维的红外光谱图Fig.5 FT-IR curves of SF nanofibers

2.4 体外降解后纤维质量变化

将乙醇处理后的纤维放入降解液中进行体外降解实验。利用质量残留百分率的变化表征材料在不同溶液中的降解速度。质量残留百分率大，质量损失就慢，降解速率慢。在PBS溶液中，纤维的性质比较稳定，降解曲线如图6所示。

由图可知，降解1天后，纤维的质量损失了0.8%，降解第30天时，累计的质量损失为10.8%，降解60天时，累计的质量损失为15%。说明再生丝素材料中的丝素蛋白质大分子在降解过程中有小部分丝素大分子可溶于PBS降解溶液。

在放线菌蛋白酶溶液中纤维的降解曲线如图6(b)所示。浸渍1 h后，纤维质量损失了4.5%，10 h后，累计的质量损失为36.4%，降解24 h后，累计的质量损失为74.4%。降解48 h时，累计的质量损失为96.9%，材料几乎完全降解。可溶的丝素中，大部分能在24 h内从丝素膜中溶解出来，相对PBS溶液来说，放线菌蛋白酶对丝素蛋白的降解有明显的促进作用。

2.5 体外降解后纤维形貌

利用扫描电镜对纤维在不同降解液中降解后的形貌进行观察。纤维在PBS溶液中的降解形态结构变化如图7所示。纤维在降解初期发生吸水溶胀，随着降解时间持续到第15 d时，纤维溶胀明显，且粗细不匀，纤维平均直径由未降解前的(221±20) nm增加到(413±28) nm，并发生部分黏连现象。到降解第60 d时，纤维直径明显变细，平均直径降低到(82±15) nm，同一根纤维粗细严重不均匀，并出现断头。随降解时间的持续，纤维断裂并出现大部分纤维严重黏连的现象。

纤维在放线菌蛋白酶溶液中的降解形态结构变化如图8所示。纤维在放线菌蛋白酶溶液中的降解随降解时间的不同，纤维形态有明显变化。纤维在降解初期发生吸水膨胀，纤维黏连，连续的纳米纤维部分发生断裂。在降解10 h后，纤维被酶攻击打断。降解20 h后，由于丝素降解为大量碎片，丝素降解速度加快[3]。降解30 h后，丝素在酶溶液中最终崩塌，直至完全溶解，说明放线菌蛋白酶对丝素的降解能力较强。体外降解实验表明，所制备的丝素纳米纤维在PBS溶液和放线菌蛋白酶溶液中表现出不同的降解特性，也说明纤维具备良好的生物降解性，为其作为生物材料在医学领域中的应用奠定基础。

图7 丝素纳米纤维在PBS溶液中降解后的SEM照片(×10 000)Fig.7 SEM of SF nanofibers at different degradation times in PBS solution (×10 000)

图8 丝素纳米纤维在放线菌蛋白酶溶液中降解后的SEM照片 (×10 000)Fig.8 SEM of SF nanofibers at different degradation times in actinomycetes protease solution (×10 000)

3 结 论

本文采用CaCl2-FA溶解体系溶解脱胶蚕丝形成丝素溶液，再将溶液干燥成膜、去离子水浸泡去盐、室温干燥形成再生丝素膜。将丝素膜二次溶解于甲酸溶液获得丝素质量分数分别为4%、6%、8%的纺丝液。结果表明，低质量分数纺丝液(4%)的黏度较低，会出现不连续液滴，高质量分数(8%)纺丝液所纺纤维直径较粗。当丝素的质量分数增至6%时，纤维直径分布主要集中在150～250 nm，纤维平均直径为(221±20) nm，离散程度小，从直径上会更有利于细胞生长，适用于生物材料。红外分析表明，乙醇处理后，会促进丝素分子构象的转变，即从α-螺旋构象向β-折叠的转变。纤维在PBS溶液中降解60 d后质量损失15%，而在放线菌蛋白酶溶液中降解48 h后质量损失96.9%，纤维降解为大量碎片直至崩塌。降解实验表明，本文制备得到的丝素纳米纤维具有可生物降解性，在放线菌蛋白酶溶液中的降解程度更明显。

FZXB

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Preparation and property research of silk fibroin nanofibers in CaCl2-formid acid system

WU Huiying1,2， ZHOU Yan1， ZUO Baoqi2,3

(1.SuzhouInstituteofTrade&Commerce，Suzhou,Jiangsu215009，China; 2.CollegeofTextile&ClothingEngineering,SoochowUniversity,Suzhou,Jiangsu215123，China; 3.NationalEngineeringLaboratoryforModernSilk(Suzhou),Suzhou,Jiangsu215123，China)

CaCl2-formic acid (FA) system was adopted to dissolve degummed silk, and the silk fibroin(SF) solution was dried and desalted to obtain SF films. Then the SF films were dissolved in FA to obtain SF solutions with concentrations of 4%, 6% and 8%, respectively. The SF nanofibers were made by electrospinning with a cylinder collector. SEM, FT-IR and in vitro degradation were applied to characterize the properties of nanofibers. The results indicated that the viscosity of solutions of low concentration (4%) was low, and discontinuous droplets will appear when electrospinning, and the diameter of fibers spun from solutions of high concentration (8%) was larger. In this paper, the fibers spun from solutions of the concentration of 6% had good forming effect and the diameter was mainly at 150-250 nm. After treatment with 75% ethanol, the conformation of SF nanofibers was transformed from α-helical to β-sheet. The degradation tests demonstrated that after degradation in PBS for 60 d, the weight loss was 15%, and the fibers have uneven diameters and adhere with one another. After degradation in actinomycetes protease solution for 48 h, the weight loss was 96.9%, and fibers were nearly degraded completely. The degree of degradation is more evident than that in PBS.

CaCl2-formic acid; silk fibroin nanofiber; electrospinning; rheological behavior; surface morphology; FT-IR; degradation

10.13475/j.fzxb.20140806606

2014-09-01

2015-01-12

江苏省应用基础研究计划项目(BK20141207)；苏州市应用基础研究计划项目(SYG201431)；2015中国纺织工业联合会科技指导项目(2015009)；2015苏州经贸职业技术学院自然基金项目(KY-ZR1401)

吴惠英(1980—)，女，讲师，博士生。主要从事丝蛋白生物材料的应用研究。左保齐，通信作者，E-mail：bqzuo@suda.edu.cn。

TS 141.8

A