海洋扩展青霉(Penicillium expansum)果胶酶的纯化及酶学性质研究

吴 爽，张 敏，潘仁瑞，蔡敬民,

（1.安徽农业大学生命科学学院，合肥230036；2.合肥学院生物与环境工程学院，合肥230601）

海洋扩展青霉(Penicillium expansum)果胶酶的纯化及酶学性质研究

吴 爽1，张 敏2，潘仁瑞2，蔡敬民1,2

（1.安徽农业大学生命科学学院，合肥230036；2.合肥学院生物与环境工程学院，合肥230601）

通过超滤、DEAESephadex A-50离子交换层析、Sephadex G-100凝胶过滤层析，对一株来自海洋的扩展青霉(Penicillium expansum)所产果胶酶进行分离纯化，得到电泳纯的果胶酶，经SDS-PAGE电泳显示单一条带，且果胶酶亚基的分子质量约为63.96 ku，纯化倍数为24.13，回收率为36.32%。酶学性质研究结果表明，该果胶酶的最适反应温度为50℃，最适pH值5.4，在pH值4.6～6.2比较稳定，Mg2+、Ca2+对果胶酶活力有明显激活作用，Cu2+有明显抑制作用，以果胶粉为底物的Vmax为393.56μg/(m in·m L)，Km为3.34mg/m L。

海洋扩展青霉；果胶酶；分离纯化；酶学性质

果胶酶(Pectinase)是指能够分解果胶质的一类酶的总称，包括聚半乳糖醛酸酶、果胶酯酶、果胶裂解酶等［1-2］。果胶酶广泛应用于果汁澄清、木材防腐、麻类脱胶、棉织物精练、天然药物活性成分提取、饲料加工、茶叶发酵、环保等领域［3-7］。国外对果胶酶的研究始于20世纪30年代，在菌种选育、发酵优化、纯化等领域已经取得了很多成果，中国从20世纪60年代开始研究果胶酶，目前生产的果胶酶纯度不高，多数要依赖进口，工业化生产落后于法国、德国、荷兰、丹麦、意大利等果胶酶的主要生产国［2］，然而中国海域辽阔，微生物资源非常丰富，因此利用高产果胶酶的海洋微生物生产果胶酶，并探索高效的纯化工艺，成为提高中国工业果胶酶品质的重要途径。

目前，果胶酶已被学者们广泛研究，已发现许多霉菌和少量细菌以及酵母菌都可以产生果胶酶，国内外科学家利用盐析、层析、液相色谱、电泳等手段对果胶酶进行纯化，研究表明，果胶酶分子质量一般在20 ku～60 ku之间，活性范围在pH值3.0～9.0之间，大部分果胶酶的最适作用温度在45℃左右［8-10］。

很多学者是从腐烂的果蔬或者果园泥土中筛选出产果胶酶的菌株［1,7,11］进行研究，对于海洋来源的产果胶酶菌株的研究鲜有报道，本文从实验室保藏的一株来自海洋的扩展青霉(Penicillium expansum)出发，对其所产果胶酶进行分离纯化，并对果胶酶的酶学性质进行了研究，旨在探索出一条高效、低耗、简捷的果胶酶纯化新工艺。同时本文所利用的果胶酶生产菌来自海洋，为新型酶制剂的开发提供了理论指导。

1 材料与方法

1.1 菌株及培养基

菌株：扩展青霉(Penicillium expansum)，分离自浙江苍南海域的海水，保藏于本实验室。

种子培养基：PDA培养基

固态发酵培养基：麸皮7 g，果胶粉0.42 g，氯化铵0.28 g，人工海水［9］8.4m L，pH值自然，121℃灭菌20m in。

液态培养基：硝酸钠0.3 g，磷酸氢二钾0.1 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，氯化钾0.05 g，硫酸亚铁0.001 g，蔗糖3 g，琼脂2 g，果胶粉1 g，蒸馏水100m L，加热溶解，121℃灭菌20m in。

1.2主要试剂及仪器

牛血清白蛋白、DEAESephadex A-50、Sephadex G-100、低分子量标准蛋白，上述试剂均购自Sigma公司。

752型紫外-可见分光光度计，上海光谱仪器股份有限公司；自动部分收集器：BSA-160型，上海沪西分析仪器厂；DYY-6C型电泳仪，北京六一仪器厂。

1.3果胶酶活力测定

采用DNS法，参考文献［13］作适当修改。

半乳糖醛酸标准曲线：精确配置1.5mg/m L的半乳糖醛酸溶液，取8支试管，分别加入0.1m L、0.2m L～0.8 m L的半乳糖醛酸溶液，分别用蒸馏水定容至1 m L，每个试管均加入3m L DNS溶液，沸水浴10m in，迅速冷却，蒸馏水定容至20m L，540 nm波长处测定吸光值，以1m L蒸馏水作为空白对照。每管重复3次，取平均值，以半乳糖醛酸含量为横坐标，吸光值（D540nm）为纵坐标，绘制标准曲线，如图1所示。得到半乳糖醛酸标准曲线的回归方程为y=0.85762 x-0.02689，相关系数R2=0.99873。

取0.2m L适当稀释的酶液于试管中，50℃水浴平衡5min，加入1.8m L水浴平衡过的0.4%的果胶底物溶液，50℃水浴反应30min后，加3m LDNS试剂终止反应，沸水浴10m in，冷却后蒸馏水定容到20m L，摇匀；以灭活的酶液做空白对照。在540 nm波长处测定吸光度。结合上述标准曲线，在上述反应体系中，以每毫升酶液1min降解果胶底物产生1μg半乳糖醛酸定义为1个酶活力单位(U)。

图1 半乳糖醛酸标准曲线Fig 1 Standard curve of galacturonic acid

1.4 蛋白含量的测定

按Bradford法［14］，以牛血清白蛋白为标准蛋白绘制标准曲线。

1.5海洋扩展青霉产果胶酶方式的确定

250m L三角瓶中装50m L液态培养基，灭菌，冷却，接种4m L孢子悬液（3×107个/m L），28℃恒温培养3 d，将发酵液于4℃，10000 r/m in离心10m in，分别收集上清液和菌体。菌体用生理盐水重悬，离心，反复清洗几次后，悬浮于同发酵上清液等体积的生理盐水中，加入溶菌酶，37℃水浴1 h［15］，使细胞破碎，细胞内含物扩散出来，并于4℃，10000 r/m in离心10m in，取上清液，分别测定发酵上清液和细胞内含物上清液的酶活力。

1.6 果胶酶的纯化

1.6.1粗酶液的制备

按发酵培养基配方配制培养基并接种2m L(107个/ m L)孢子悬液，28℃条件下培养3 d取出，每瓶固态发酵酶曲中倒入50m L pH值5.4，0.04mol/LNa2HPO4～0.02 mol/L柠檬酸缓冲液，室温浸提1 h，浸提液用6层纱布过滤，再经4℃，10000 r/min离心10min，去除残留的菌丝体及杂质，上清液即为粗酶液。

1.6.2超滤

取粗酶液，分别使用截留分子质量为100 ku和30 ku的超滤膜对上清液进行超滤，取分子质量在30 ku和100 ku之间的部分备用。

1.6.3DEAESephadex A-50离子交换层析

将上述所得酶液在 pH值 5.4，0.04 mol/L Na2HPO4～0.02 mol/L柠檬酸缓冲液中透析后，用PEG20000浓缩，再经4℃，10000 r/m in离心10m in，取上清液，上样于相同缓冲液平衡好的DEAE-Sephadex A50离子交换层析柱（1.6 cm×30 cm，床层体积50m L），用0～1mol/LNaCl和上述缓冲液进行线性梯度洗脱，流速1m L/m in，每管5m L，收集有酶活力的蛋白峰［9］，超滤浓缩后备用。

1.6.4 Sephadex G-100凝胶过滤层析

上述所得酶液经4℃，10000 r/min离心10min后，上清液上样15m L于pH值5.4，0.04mol/L Na2HPO4～0.02mol/L柠檬酸缓冲液平衡后Sephadex G-100凝胶过滤层析柱（2.6 cm×100 cm）［16］，用同样的缓冲液洗脱，流速为0.3m L/min，收集有酶活力的蛋白峰，透析浓缩。

1.7纯度鉴定及分子量的测定

利用SDS-PAGE电泳［17］测定酶的分子量，浓缩胶3%，分离胶12%，起始电压为200V，进入分离胶后，电压调整为150V，考马斯亮蓝R250染色。

1.8酶学性质

1.8.1最适反应温度及温度稳定性

果胶酶与底物在不同温度（30℃、40℃、50℃、60℃和70℃）下反应，测定酶活力，得最适反应温度；将果胶酶在不同温度（30℃、40℃、50℃、60℃和70℃）下保温120m in，每隔20m in测1次酶活力，研究果胶酶的温度稳定性。

1.8.2最适反应pH值及稳定性

果胶酶与不同pH值（3.0、3.8、4.6、5.0、5.4、5.8、6.2、7.0、7.8和8.6）的缓冲液所配制的果胶底物反应，测定酶活力，得果胶酶的最适反应pH值；将果胶酶用不同pH值（3.0、3.8,4.6、5.0、5.4、5.8、6.2、7.0、7.8和8.6）的缓冲液处理2 h后，测定酶活力，研究果胶酶的pH稳定性。

1.8.3不同金属离子对果胶酶的影响

向酶反应体系中分别加入不同金属离子(Mg2+、Cu2+、Zn2+、Ca2+、Al3+、Fe2+、Mn2+、K+)［18］，使其在体系中的浓度为2mmol/L，测定酶活力。

1.8.4果胶酶动力学常数的测定

果胶酶分别与不同浓度（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%和0.6%）的果胶底物在最适条件下反应，测定酶活力，根据Lineweave-Burk双倒数法作图，利用公式1/V=1/V max+(K m/V max)·(1/〔S〕)，求出果胶酶的动力学常数［19］。

1.9 数据处理方法

使用Spss20.0中的LSD法进行方差分析和多重比较。

2 结果与分析

2.1海洋扩展青霉产果胶酶方式的确定

检测到细胞内含物上清液中酶活几乎为0，发酵上清液有较高酶活力，说明该果胶酶为胞外酶。

图2 果胶酶DEAE Sephadex A-50离子交换层析图Fig 2 Elution profileof pectinaseon DEAESephadex A-50 column

2.2 DEAESephadex A-50离子交换层析如图2所示，超滤后的酶液经DEAESephadex A-50离子交换层析后，出现3个蛋白峰，检测到第3个峰有酶活，前2个蛋白峰没有酶活，为杂蛋白，离子交换层析是根据吸附力大小分离蛋白质的，第1个峰处的杂蛋白吸附力最小，先被洗脱下来，果胶酶的吸附力大，最后被洗脱下来，前2个峰处的杂蛋白分子量可能比果胶酶分子量小，也可能比果胶酶分子量大。

2.3 Sephadex G-100凝胶过滤层析

图3 果胶酶Sephadex G-100凝胶过滤层析图Fig 3 Elution profileof pectinaseon Sephadex G-100 column

离子交换层析后，收集有酶活的第3个蛋白峰，经Sephadex G-100凝胶过滤层析后，出现3个较明显的蛋白峰，如图3所示，检测到第2个蛋白峰有酶活，为果胶酶所在的峰，另外2个蛋白峰没有酶活，为杂蛋白，根据凝胶过滤层析的原理，大分子先被洗脱下来，小分子后被洗脱下来，说明第1个峰处的杂蛋白分子量大于果胶酶分子量，第3个峰处的杂蛋白分子量小于果胶酶分子量，且从图2可以看出，杂蛋白含量明显比果胶酶含量低。

2.4 果胶酶的纯化结果

表1 果胶酶的提纯结果Table1 Summary of purification of pectinase

由表1可知，经3步纯化后，果胶酶被提纯了24.13倍，回收率为36.32%。

2.5 果胶酶分子量测定结果

如图4所示，纯化后的酶液经SDS-PAGE电泳显示单一的条带，说明纯化后的果胶酶只有单一的亚基，酶液已达到电泳纯，以Marker中各蛋白的相对迁移率Rf为横坐标，分子质量的对数值lg M r为纵坐标，得标准曲线lg Mr=-1.8784Rf+2.6988（R2=0.9749），代入样品的迁移率，计算得果胶酶亚基的分子质量为63.96 ku，这与张名爱［12］的研究结果61.4 ku接近。

图4 纯化的果胶酶SDS-PAGEFig 4 SDS-PAGE pattern of purified pectinase

2.6果胶酶的最适反应温度及温度稳定性

如图5所示，随着温度上升，果胶酶活力呈先上升后下降趋势，当温度低于50℃或高于50℃时，酶活力显著下降（P＜0.05），50℃酶活力最高，表明该海洋扩展青霉所产果胶酶的最适反应温度为50℃。

图5 果胶酶的最适反应温度Fig 5 Theoptimum reaction temperatureof pectinase

图6 果胶酶的温度稳定性Fig 6 The temperature stability of pectinase

由图6可知，随着保温时间的延长，果胶酶活力逐渐下降，30℃保温120m in，果胶酶活力下降不显著，说明果胶酶在30℃，稳定性好，40℃保温80min后，酶活力开始显著下降（P＜0.05），在50℃、60℃和70℃中，随着保温时间延长，酶活力显著（P＜0.05）下降；50℃、60℃和70℃保温，相同时间点酶活力呈下降趋势，并且与30℃对应时间点酶活力相比，下降显著（P＜0.05）；50℃保温80min，酶活力保留率为52.58%，50℃保温120m in，酶活保留率为44.60%；60℃保温20m in，酶活保留率为54.81%，70℃保温20 m in，酶活为初始的40.64%。60℃和70℃保温120min后，酶活力保留率均在10%以下。

2.7果胶酶的最适pH值及稳定性

如图7所示，随pH值上升，果胶酶活力先上升后下降，pH值小于5.0或大于5.8，酶活力显著下降（P＜0.05），pH值5.4时酶活力最高，表明果胶酶最适反应pH值5.4。

如图7所示，pH值低于4.6或高于6.2，酶活力显著下降（P＜0.05），pH值4.6～6.2范围内，酶活力基本稳定，且显著（P＜0.05）高于其他pH值的酶活力，表明果胶酶在pH值4.6～6.2范围内稳定。

2.8金属离子对果胶酶活力的影响

如表2所示，金属离子对果胶酶活力促进作用顺序Mg2+＞Ca2+＞Na+＞Sr2+＞Co2+＞K+，对果胶酶活力抑制作用大小Cu2+＞Zn2+＞Fe2+，Mg2+、Ca2+对果胶酶有很强的激活作用，Mn2+对果胶酶活力几乎无影响，Cu2+有对果胶酶有很强的抑制作用。

图7 果胶酶的最适pH值及稳定性Fig 7 Theoptimum reaction pH and pH stability of pectinase

表2 金属离子对果胶酶活力的影响Table2 Effectofmetal ionson theactivity of pectinase

2.9 果胶酶的反应动力学研究

果胶酶分别与不同浓度的果胶底物（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%和0.6%）在最适条件下反应，测定酶活力，根据Lineweave-Burk双倒数法作图8，利用公式:1/V=1/V max+(K m/V max)·(1/〔S〕)，求出果胶酶的动力学常数，当以果胶为底物时，V max为393.56 μg/(min·m L)，K m为3.34mg/m L。

图8 果胶酶的Lineweaver-Burk图Fig 8 Lineweaver-Burk plotof pectinase

3 讨论

对一株海洋扩展青霉(Penicillium expansum)所产果胶酶进行纯化，经超滤、DEAE Sephadex A-50离子交换层析、Sephadex G-100凝胶过滤层析后，获得电泳纯的果胶酶，其亚基单一的分子质量约为63.96 ku，纯化倍数为24.13，回收率为36.32%，该酶的最适反应温度为50℃，在30℃稳定，40℃较稳定；最适反应pH值5.4，在pH值4.6～6.2比较稳定；对果胶酶活力促进作用大小顺序Mg2+＞Ca2+＞Na+＞Sr2+＞Co2+＞K+，Mn2+对果胶酶活力无影响，对果胶酶活力抑制作用大小Cu2+＞Zn2+＞Fe2+。Mg2+、Ca2+对果胶酶活力有很强激活作用，Cu2+有很强抑制作用，Mn2+几乎不影响果胶酶活力；以果胶粉为底物的V max为393.56μg/(min·m L)，K m为3.34mg/m L。

许多学者对酶的纯化，首先采用硫酸铵沉淀，此方法操作起来比较耗时，而且很容易因局部硫酸铵浓度过大，使酶变性失活。本文采用超滤的方法，操作起来比较简捷，而且因为是物理分离，酶活损失非常少。本文研究的果胶酶分子质量约为63.96 ku，与张名爱［9］的研究结果61.4 ku比较接近，张名爱研究的草酸青霉果胶酶最适作用pH值为5.0，最适反应温度为40℃，pH值稳定范围为4.0～6.0，与本文研究的果胶酶最适温度有一定差距，最适pH值比较接近，稳定范围相对小一点，蓝丽精等［10］研究的果胶酶最适反应温度为50℃，最适反应pH值5.0，与本研究结果相近但有少部分区别，可能是果胶酶产生菌不同，表达果胶酶的基因不同，造成果胶酶蛋白分子结构有所不同，使得性质也有区别。

中国海域辽阔，海洋微生物资源非常丰富，且容易获得，海洋中有陆地上不存在的微生物，以海洋微生物出发，寻求稳定性好，活力高的果胶酶，应用于工业生产，有利于提高我国果胶酶制剂的品质。本文为探究海洋真菌所产果胶酶的性质，分子结构等提供了理论指导。

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Purification and enzymatic charactersof pectinase from marine Penicillium expansum

WU Shuang1，ZHANGM in2，PAN Ren-rui2，CAIJing-m in1,2

(1.College of Life Sciences,AnhuiAgriculturalUniversity,Hefei230036; 2.Schoolof Biologicaland EnvironmentalEngineering,HefeiUniversity,Hefei230601,China)

Pectinase from marine Penicillium expansum was separated and purified by ultrafiltration,DEAESephadex A-50 ion exchange chromatography,Sephadex G-100 gel filtration chromatography.SDS-PAGE of the purified pectinase revealed a single band atan apparentmolecularmassof 63.96 ku.Resultshowed thatpectinasewas purified by 24.13 foldsw ith a yield of 36.32%.The enzymology properties revealed that theoptimal reaction temperaturewas50℃,and theoptimalpH was5.4.Pectinasewasstable in the range of pH4.6-6.2.Mg2+and Ca2+had obviousactivation on pectinase activity,however Cu2+had obvious inhibition.Vmax and Km for jelly powderwere 393.56μg/(m in·m L)and 3.34mg/m L,respectively.

marine Penicillium expansum;pectinase;purification;enzymology properties

Q814.1;TQ925.3

A

2095－1736（2015）03－0037－05

10.3969/j.issn.2095-1736.2015.03.037

2014-10-30；

2014-12-01

安徽省教育厅自然科学项目（KJ2012B153）

吴 爽，硕士，从事微生物酶学和海洋微生物活性天然产物研究，E-mail：wushuangsunshine@163.com。

蔡敬民，教授，博士，硕士生导师，从事微生物酶学和海洋微生物活性天然产物研究，E-mail：caijingmin@hfuu.edu.cn。