PLSCR1真核表达载体的构建及细胞内定位分析

王 远，陈 英，张学清，陈忠民，田喜凤，陈 晶

（1.河北联合大学,河北唐山063000；2.北京军事医学科学院,北京100850）

PLSCR1真核表达载体的构建及细胞内定位分析

王 远1,2，陈 英2，张学清2，陈忠民2，田喜凤1，陈 晶1

（1.河北联合大学,河北唐山063000；2.北京军事医学科学院,北京100850）

分别构建带有myc标签和GFP荧光蛋白的磷脂爬行酶1（PLSCR1）真核表达载体，获得两个融合表达载体，并转入HEK293细胞观察表达情况及细胞内定位，为研究PLSCR1的定位与功能的关系奠定基础。以本实验室保存的Hela cDNA文库为模板，采用PCR技术扩增PLSCR1编码序列，将其分别插入pCMV-M yc-N和pEGFP-C1载体，Western blotting检测其在HEK293中的表达，采用激光共聚焦观察pEGFP-C1融合表达载体在HEK293细胞中定位。通过DNA序列分析，证实了成功构建了PLSCR1真核表达载体，并能在HEK293细胞中实现基因的过表达。成功构建PLSCR1真核表达载体，为进一步研究其功能奠定了基础。

磷脂爬行酶1；真核表达载体；HEK293细胞

PLSCR1（phospholipid scramblase 1，磷脂爬行酶1）属于Ca2+结合的棕榈酰化Ⅱ型膜蛋白，棕榈酰化后定位于细胞膜，非棕榈酰化的PLSCR1蛋白可定位于细胞核内，并与基因组DNA结合［1-2］。目前确定人类PLSCR1定位于染色体3q23，其核酸分子含29.7 kb，共编码318个氨基酸，蛋白质分子质量大约为35.1 ku［3］。PLSCR1参与细胞的增殖、分化和凋亡过程，同时是多种激酶的底物［4］。近年许多研究表明，PLSCR1参与了肿瘤细胞的生长、增殖以及细胞的迁移［5-6］。为了进一步了解PLSCR1细胞内定位与功能关系，我们分别构建了pCMV-Myc-N-PLSCR1和pEGFP-C1-PLSCR1的真核表达载体。

1 材料与方法

1.1材料

HEK293细胞由本实验室传代培养；pCMV-Myc-N载体和pEGFP-C1载体由本实验室保存；Pyrobest DNA Polymerase、限制性内切酶包括Sal I、Xho I和Bam H I、T4 DNA Ligase均购自TaKaRa公司；鼠抗Myc单抗、鼠抗GFP单抗、辣根酶标记山羊抗小鼠IgG购自中杉金桥公司，琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒、质粒小量快速提取试剂盒、2×Taq PCR MasterM ix、BMJM 109感受态细胞、BM 2000DNAMarker均购自博迈德生物公司；DMEM购自Gibco公司，特级胎牛血清购自北京元亨圣马生物技术研究所。

1.2 方法

1.2.1 PCR扩增目的基因

以本实验室保存的Hela cDNA为模板，设计的2组引物扩增目的基因。A组引物：上游P1:5'CGTCGACCATGGACAAACAAAACTCACAG3'，下游P2:5'GGC TCGAGGTAATCCACTACCACACTCCTG3'；B组引物：上游P3：5'CGTCGACATGGACAAACAAAACTCACA G3'，下游P4:5'CGGATCCTAATCCACTACCACACTC CTG 3'。反应条件：94℃30 s，55℃30 s，72℃1m in，扩增30个循环，72℃延伸10m in。使用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒回收PCR产物。

1.2.2 重组质粒的构建及鉴定

将回收的A组PCR产物与pCMV-M yc-N质粒同时用Sal I和Xho I进行双酶切；将回收的B组PCR产物与pEGFP-C1质粒同时用Sal I和Bam HⅠ进行双酶切。回收外源片段后进行连接反应，连接产物转化入JM 109感受态细胞中，挑选单克隆，扩大培养，提取质粒，将测序正确的扩大培养，提取DNA质粒待用。

1.2.3 HEK293细胞转染

将预先培养的HEK293细胞在6孔板长至密度为70%左右，进行转染。每个孔取5μL转染试剂，加入95μL的无血清无抗生素的DMEM培养液中；取3.2 μg DNA质粒加入到无血清的DMEM培养液中，总体积为100μL。室温反应5min后，将稀释好的100μL转染试剂与稀释好的100μL质粒混匀，室温15m in后加入含1m L 10%血清的新鲜DMEM培养液六孔板中，在5%CO2、37℃恒温培养箱中培养24 h，同时设置阴性对照。

1.2.4 Western-blot检测转染HEK293细胞PLSCR1蛋白的表达

收获转染了pCMV-Myc-N、pEGFP-C1空载体和pCMV-Myc-N-PLSCR1、pEGFP-C1-PLSCR1融合载体以及未转染的细胞，加入2×SDS缓冲液沸水煮10 min。配制10%聚丙烯酰胺凝胶，每个孔20μL蛋白裂解液，120 V恒压电泳2 h，90 V恒压转膜35min，用TBST配制的5%脱脂牛奶封闭膜2 h，分别加入myc、GFP抗体（1∶500），4℃孵育过夜，TBST洗3次，每次5 min。加入1∶10000稀释二抗，室温孵育2 h，TBST洗3次，每次5min。暗室内X线胶片压片显影。

1.2.5激光共聚焦分析转染HEK293细胞PLSCR1蛋白的定位

将无菌盖玻片放置于6孔板内，0.1mg/m L的多聚赖氨酸浸泡过夜，PBS漂洗后紫外线照射干燥。接种HEK293细胞至预处理过的6孔板，细胞爬片生长24 h后，细胞密度约为50%，将pEGFP-C1-PLSCR1质粒和pEGFP-C1质粒分别进行转染，每孔转染质粒总量为3.2μg。24 h后，4%多聚甲醛固定，室温10m in。PBS洗3次，每次5min。DAPI用PBS按1∶500稀释，对细胞进行染色8min，PBS洗3次，每次5m in。50%甘油封片，显微镜下观察分析。

2 结果

2.1 PLSCR1全长序列获取

PCR扩增PLSCR1获得长度约为975 bp的片段（图1）,与预期相符。

图1 PLSCR1电泳产物Fig 1 Amplification of PLSCR1 geneby PCR1—A组引物扩增的目的条带；2—B组引物扩增的目的条带；M—2000maker。

2.2重组表达载体测序鉴定

挑选阳性克隆进行测序分析，DNA测序结果表明插入的外源片段与插入方向和碱基序列是正确的。其分别命名为pCMV-M yc-N-PLSCR1和pEGFP-C1-PLSCR1。测序序列与原始PLSCR1的CDS序列完全一致。

2.3 Western blot方法检测PLSCR1蛋白在HEK293细胞中的表达

pCMV-Myc-N-PLSCR1在35 ku左右有明显条带，同时阴性对照pCMV-Myc-N在35 ku左右未检测出目的条带；pEGFP-C1-PLSCR1在63 ku左右见明显条带，空载体pEGFP-C1在28 ku左右有明显条带，在63 ku左右未检测出蛋白条带（图2），与预期蛋白大小相同，表明构建的载体在HEK293细胞中成功表达了PLSCR1蛋白。

图2 Western blot检测PLSCR1蛋白在HEK293细胞表达Fig 2 Westernblotdetection PLSCR1 proteinexpression inHEK293 cellsA—pCMV-Myc-PLSCR1在细胞中的表达；B pEGFP-C1-PLSCR1在细胞中的表达。

2.4激光共聚焦分析PLSCR1的细胞内定位

将制作好的样本在显微镜下观察，可以明显观察到PLSCR1蛋白主要集中于细胞核，同时在细胞质中也有表达，而pEGFP-C1是全细胞表达的（图3）。

图3 PLSCR1的细胞内定位Fig 3 Cellular localization of PLSCR1A1—pEGFP-C1-PLSCR1在HEK293细胞中表达；A2—细胞核；A3—合成图；B1—pEGFP-C1质粒在HEK293细胞中表达；B2—细胞核；B3—合成图。

3 讨论

PLSCR1蛋白广泛分布于细胞及组织中，在生物体内发挥着多种生物学功能，并参与细胞生长、增殖、凋亡等过程。近来越来越多的研究表明，PLSCR1可能在白血病细胞分化方面起作用［7］，抑制肿瘤细胞增长以及促进干扰素的抗病毒作用［8-9］。研究显示，PLSCR1在系统性红斑狼疮病人单核细胞［10］中有较高的水平表达。相关文献报道，PLSCR1在结直肠癌细胞株Lovo HR8348中的表达较强，提示了在结直肠癌的发生进展和转移过程中，PLSCR1可能起到了重要的作用［11］。

为了对PLSCR1的定位与功能的关系进行更深入的研究，我们首先成功构建了PLSCR1真核表达载体，并实现其在HEK293中的表达。相关文献报道，由于PLSCR1在细胞因子（IFN）诱导下的表达没有被棕榈酰化，PLSCR1蛋白可进入到细胞核内并结合基因组DNA［12-13］，同时也提示了PLSCR1蛋白可能与基因的转录调控相关［13］。也有文献报道，在As2O3细胞系的研究中发现PLSCR1蛋白定位在细胞膜上［14］；在研究PLSCR1与TLR9的相互作用时，发现其定位在细胞膜上［15］，因此提示其定位与其功能有相关性。我们成功构建含有myc标签的PLSCR1表达载体，同时成功构建表达PLSCR1和GFP融合蛋白的表达载体，转染HEK293细胞发现其主要表达于细胞核中，同时在细胞质中和细胞膜上也有表达。我们在研究辐射诱导基因LOC401296时，发现PLSCR1与LOC401296可能存在共定位，但LOC401296的分子机制不清楚［16］，因此该载体的构建为后续研究PLSCR1的定位与功能的关系，同时为LOC401296的功能研究奠定了基础。

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Construction of theeukaryotic expression vector of PLSCR1 and analysisof its intracellular localization

WANGYuan1,2，CHENYing2，ZHANG Xue-qing2，CHEN Zhong-m in2, TIAN Xi-feng1，CHEN Jing1

(1.HebeiUnited University，Tangshan 063000; 2.Institute of Radiation Medicine，Academy ofM ilitary MedicalSciences，Beijing 100850，China)

Two eukaryotic expression vectors of phospholipid scramblase 1（PLSCR1）w ith myc-tag or Green Fluorescent Protein (GFP),were constructed to obtain two fusion expression vectors,which were transfected to HEK293 cell,to observe the expression and cellular localization.The resultswould lay a foundation for the study of PLSCR1 gene localization and functional relationships. Hela cDNA library preserved in our laboratory was used as template,the PLSCR1 coding sequence was amplified by PCR and respectively inserted into the vector pCMV-Myc-N and pEGFP-C1.The epression was detected in HEK293 by Western blotting and localization of pEGFP-C1 fusion expression vector in HEK293 cells by laser scanning confocalm icroscopy.As results,the eukaryotic expression vector of PLSCR1 was successfully constructed by the DNA sequence analysis,and over expressed genes in HEK293 cells.Itmakesgood foundation for further study of functionsby successfully constructing eukaryotic expression vectorof PLSCR1.

PLSCR1;eukaryotic expression vector;HEK293 cell

Q78

A

2095－1736（2015）03－0001－03

10.3969/j.issn.2095-1736.2015.03.001

2014-11-12；

2014-11-28

国家自然科学基金青年基金项目（81402631）

王远，河北联合大学基础医学院2013级在读硕士研究生，主要研究方向为病原生物学，E-mail:applegirl0319@163.com；

陈晶，副教授，主要研究方向为细胞生物学，E-mail:j.chencn@163.com。