CD151在垂体腺瘤中的表达及意义*

李 曙， 洪 云， 胡再昌， 金 鑫， 孙盼盼， 聂刘旺, 周岩方

(1. 皖南医学院病理生理学教研室， 2. 弋矶山医院超声医学科， 3. 药理学教研室， 安徽 芜湖 241002；4. 安徽师范大学生命科学院， 芜湖 241000； 5. 温州医学院附属黄岩医院神经外科， 浙江 台州 318020)



CD151在垂体腺瘤中的表达及意义*

李 曙1，4， 洪 云2， 胡再昌1， 金 鑫3， 孙盼盼3， 聂刘旺4, 周岩方5△

(1. 皖南医学院病理生理学教研室， 2. 弋矶山医院超声医学科， 3. 药理学教研室， 安徽 芜湖 241002；4. 安徽师范大学生命科学院， 芜湖 241000； 5. 温州医学院附属黄岩医院神经外科， 浙江 台州 318020)

目的：探讨CD151在垂体腺瘤中的表达及意义。方法：收集36例垂体腺瘤标本，5例正常垂体组织，通过Real time-PCR、Western blot及免疫组化方法，从mRNA和蛋白水平检测CD151在36例垂体腺瘤、5例正常垂体组织的表达。结果：Real time-PCR及Western blot、免疫组化发现CD151在垂体肿瘤组织中表达显著高于正常垂体组织(P<0.01)，在非侵袭性腺瘤和侵袭性腺瘤中的蛋白及mRNA表达量两者之间有显著差异(P<0.01)。结论：CD151的表达与肿瘤大小及侵袭程度相关，表明CD151的表达与肿瘤的发生、发展密切相关，检测CD151有可能预测垂体腺瘤预后的重要指标。

CD151；垂体腺瘤；Real time-PCR；Western blot；免疫组化

CD151属于跨膜四蛋白超家族(transmenbrane 4 super family，TM4SF)，通过与整合素的特异性结合，参与调控细胞黏附、迁移和增殖等众多病理生理过程，研究证实[1]， CD151在多种肿瘤中存在过表达，并且参与肿瘤的侵袭与转移，在多种恶性肿瘤中表达明显增加，其表达水平与部分肿瘤的病理分级和临床分期、预后[2-4]密切相关，但在垂体腺瘤中的表达情况未见报道。我们通过检测垂体腺瘤与正常垂体组织中CD151蛋白及mRNA的表达水平并分析其与垂体腺瘤临床病理学因素的关系，探讨CD151在垂体腺瘤中的作用。

1 材料与方法

1.1 组织

从皖南医学院附属医院神经外科，2011年5月至2014年5月手术切除的36例标本，术后病理证实为垂体腺瘤，取出后置液氮保存；男性16例，女性20例，年龄21～68岁，平均(42.5±7.8)岁。其中无功能腺瘤12例、PRL腺瘤10例、GH腺瘤8例、6例ACTH腺瘤。根据影像学表现按肿瘤直径分大腺瘤30例(>1 cm)，微腺瘤6例(<1 cm)。侵袭性腺瘤23例，非侵袭性腺瘤13例。肿瘤侵袭性的判定标准[5]：(1)Hardy-Knosp分级分期，III级或以上及C-E期认为是侵袭性垂体腺瘤；(2)鞍底硬膜和邻近骨质经病理证实有肿瘤细胞；(3)影像学检查见肿瘤包绕双侧颈内动脉。凡符合上述3项中的任何一项者均归为侵袭性组。以5例正常垂体组织作为阴性对照组(教学用尸颅，解剖获得)。

1.2 试剂及仪器

SuperScript反转录试剂盒、SYBRGreen 定量PCR试剂盒购自美国Invitrogen 公司，RIPA裂解液、蛋白酶K(Sigma公司)，Western blot reagent A液和B液(Santa Cruz公司)，鼠抗人CD151单克隆抗体(1∶400 Santa Cruz公司)，NC膜(Roche公司)，HRP标记的羊抗鼠I (1∶500 Jackson公司)，Proteam@I．IXiCell电泳仪(Bio．Rad公司)低温高速离心机(EDpendorf)，凝胶成像仪(UVPEPS．300稳压稳流电泳仪(Tanon)，PB3002．S电子天平(Metter)。

1.3 real time-PCR检测CD151 mRNA在垂体瘤中的表达

Trizol法提取组织总RNA，测定RNA样品的纯度。取1 μgRNA进行反转录，条件如下：25℃10 min；50℃ 30 min；85℃5 min。冰上骤冷；反转录得cDNA保存在-20℃。取合成的cDNA为模板，用SYBR Green法进行real time-PCR扩增，采用Comparative Delta-delta 法计算各基因相对表达量：先对样品中的目的基因与管家基因分别扩增效率，将扩增效率优化为一致，并确定此时阈值使两标准曲线斜率差值M小于0.1，正常组均值为1.0，计算各组表达量的相对值。

CD151基因上游引物序列为： 5’-GCACCGTTTGCCTCAAGT-3’，下游引物序列为：5’-ACCACCAGGATGTAGGCTGT-3’；

β-actin上游引物：5’-GAAGGTGAAGGTCGG-AGTC-3’，下游引物： 5’-GAAGATGGTGATGGGA-TTTC-3’。

1.4 Western blot检测CD151在垂体瘤组织中表达

总蛋白采用一步提取法，-80℃冰箱保存，0.25 μg蛋白，SDS-PAGE电泳(10%)。NC膜放人封闭缓冲液室温封闭1 h，加入鼠抗人CD151单克隆抗体，4℃过夜；HRP标记的羊抗鼠IgG，37℃×1 h，最后用PBS再漂洗10 min；采用ECL化学发光法显色，拍照、显影。自动图像分析仪对蛋白条带扫描、分析。

1.5 免疫组化染色

石蜡包埋标本，切片厚度10 μm，置温箱，55℃中烘烤过夜。用兔抗人多克隆CD151抗体(ab71816，Abcam) ABC 法行免疫组化染色，具体方法按福州迈新生物技术公司产品说明进行，CD151一抗终浓度为1∶100，二抗浓度为1∶200，苏木精复染。以细胞核染色作为确切的阳性染色标准，标准分级：(1)阴性：细胞质内无棕黄色沉淀，与阴性对照类似，随机视野中未发现阳性细胞。(2)弱阳性：胞质内均匀分布浅棕黄色反应，阳性细胞数<25%。(3)中等阳性：胞质内深棕黄色反应，阳性细胞数25%～50%。(4)强阳性：胞质中出现棕黑色反应，胞质内呈粗大颗粒或块状着色，阳性细胞数>50%。每个标本选取5个典型阳性染色视野区，取其平均值进行分析。

1.6 统计分析

2 结果

2.1 垂体腺瘤组织中CD151mRNA水平

real time-PCR结果提示CD151mRNA在垂体瘤组织中明显上调(图1)，正常的垂体组织(1.00±1.89)、非侵袭垂体腺瘤(17.63±8.35)、侵袭性垂体腺瘤(58.92±18.65)间比较，差异明显具有统计学意义(P<0.01)，与正常的垂体组织相比，在非侵袭性和侵袭性垂体腺瘤CD151 mRNA水平，差异具有统计学意义(P<0.01)，在非侵袭和侵袭性垂体腺瘤之间比较也有统计学意义(P<0.01)。

Fig. 1 mRNA expression of CD151 in each tissue detected by real-time PCR A: Normal pituitary tissue； B: Non-invasive pituitary adenomas； C: Invasive pituitary adenomas**P<0.01vsnormal pituitary tissue;##P<0.01vsnon-invasive pituitary adenomas

2.2 垂体腺瘤组织中CD151蛋白的表达

以β-actin作为内对照，结果显示在36例垂体腺瘤中都有丰富的表达，而在正常的垂体组织中则有微弱的表达(图2)。将垂体腺瘤组织中的CD151表达与正常垂体组织中的表达进行比较，差异具有显著性(P<0.01)，将36例垂体腺瘤根据影像学表现按肿瘤直径大小分为大腺瘤30例、微腺瘤6例。在非侵袭性腺瘤和侵袭性腺瘤中的表达量分别为0.39±0.18、0.72±0.23，两者之间有显著差异(P<0.01)。垂体腺瘤组织中CD151表达与肿瘤直径大小也密切相关，在大腺瘤和微腺瘤中的表达量分别为0.63±0.21、0.31±0.16，两者之间有显著差异(P<0.01，表1)。

Fig. 2 Protein expression of CD151 in pituitary adenomas N: Normal pituitary tissue; ACTH: Adrenocorticotropic hormone pituitary tumor; PRL: Pituitary prolactinoma; NF: Non-functioning adenomas; GH: Growth hormone pituitary tumor

TumortypesnExpressionindexNormalpituitarytisse50.09±0.03Microadenoma60.31±0.16**Pituitarymacroadenoma300.63±0.21**InvasivenessYes230.72±0.21InvasivenessNo130.39±0.18##

**P<0.01vsnormal pituitary tissue;##P<0.01vsinvasiveness yes group

2.3 免疫组化CD151蛋白在垂体腺瘤中的表达

CD151蛋白主要表达于垂体腺瘤细胞胞浆及胞膜内， 在正常脑组织内无CD151阳性表达。在侵袭性和非侵袭垂体腺瘤中，CD151阳性表达率分别95.6%及76.9%，与正常垂体组织相比具有显著性差异(P<0.01)；侵袭性和非侵袭垂体腺瘤之间CD151蛋白表达具有统计学显著差异(P<0.01，表2，图3)。

Tab. 2 Protein expression of CD151 in each tissue detected by immunohistochemical analysis

GroupnProteinexpressionofCD151(%(n))-++++++Normal5100(5)InvasivenessYes234.3(1)13.0(3)43.5(10)31.1(9)InvasivenessNo1323.1(3)30.8(4)30.8(4)15.4(2)

P<0.001 invasivenessvsnormal pituitary tissue;P<0.01 invasive pituitary adenomasvsnon-invasive pituitary adenomas

3 讨论

CD151基因是TM4SF家族最早被报道的促癌基因，定位于人染色体11P15.5，其表达的蛋白产物除了在正常组织中广泛表达外，在多种肿瘤细胞组织中都有较高水平的表达：如卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌和直肠癌等[5-8]。近年研究证实CD151在肿瘤细胞的迁移，浸润和转移中起重要作用，CD151在肿瘤组织中差异性表达与肿瘤的转移和预后密切相关[9]。Ang等[10]使用免疫组化研究证实前列腺癌CD151的表达明显高于良性前列腺增生的组织，并且低分化前列腺癌组织中CD151的染色强，而分化良好的前列腺癌组织中CD151的染色弱，CD151表达水平越高提示预后不良。Hashida等[11]使用免疫组化与RT-PCR技术对146例结肠癌患者肿瘤组织中CD151检测并结合患者生存时间随访，发现其中81(81/146)例有CD151基因及蛋白表达明显增高，且CDI51低表达的患者3年生存期明显高于CD151高表达患者。

Fig. 3 Histopathology of CD151 in each tissue detected by immunohistochemistry (×400) A: Normal pituitary tissue；B: Non-invasive pituitary adenomas; C: Invasive pituitary adenomas

我们用实时定量PCR检测了36例垂体腺瘤组织及其相对应的5例正常垂体组织CD151基因表达，结果发现CD151在垂体腺瘤组织中比正常垂体组织中明显增高，且侵袭性垂体腺瘤比非侵袭性垂体腺瘤水平增高。Western blot检测发现36例垂体腺瘤中均有CD151表达，且明显高于5例正常垂体组织。垂体腺瘤组织中的CD151蛋白表达与肿瘤直径大小也密切相关，在大腺瘤和微腺瘤中的表达量(0.63±0.21、0.31±0.16)，两者之间有显著差异；而在非侵袭性腺瘤和侵袭性腺瘤中的表达量(0.39±0.18、0.72±0.23)，两者之间也有显著差异。结果提示从正常垂体组织到垂体微腺瘤、垂体大腺瘤随着垂体腺瘤的增大CD151蛋白表达也进一步增加，推测CD151表达与肿瘤细胞的增殖侵袭密切相关，表明CD151在垂体腺瘤发生发展中可能起重要的作用，从而有可能为临床疗效观察和预后判断提供一个新的指标。CD151促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭与CD151-α3β1/α6β1复合体的形成密切相关，尤其是CD151-α3β1，Transwell实验显示肿瘤细胞侵袭性由CD151-α3β1复合体产生作用[12]，Elisabeth研究也证实CD151可以通过α3β1整合素促进乳腺癌的生长和分化[13]，然而在垂体腺瘤方面是否也与α3β1有关尚不清楚，因此CD151通过何种信号传导通路促进垂体腺瘤发生进展，以及CD151siRNA对垂体腺瘤增殖和转移有无抑制作用等问题需进一步研究证实。

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The expression and significance of CD151 in pituitary adenomas

LI Shu1,4, HONG Yun2, HU Zai-chang1, JIN Xin3, SUN Pan-pan3, NIE Liu-wang4, ZHOU Yan-fang5△

(1. Department of Pathophysiology, 2. Department of Ultrasonography, Yijishan Hospital， 3. Department of Pharmacology, Wannan Medical College,Wuhu 241002； 4. Life Science College, Anhui Normal University, Wuhu 241000; 5. Department of Neurosurgery, Huangyan HospitalAffiliated to Wenzhou Medical College, Taizhou 318020, China)

Objective: To investigate the expression and significance of CD151 in pituitary adenomas. Methods: Thirty-six pituitary adenomas were collected immediately after surgery together with five normal pituitary tissue. Real time-PCR, Western blot and immunohistochemistry analysis were performed to detect the expression of CD151 mRNA and protein in thirty-six pituitary adenomases and five normal pituitary tissues. Results: The expression of CD151 in all pituitary adenomases was observed to be significantly higher than that in normal pituitary tissues by Western blot, real time PCR, and immunohistochemistry analysis (P<0.01). The expression levels of protein and mRNA in invasive pituitary adenomas were much higher than those in non-invasive pituitary adenomas (P<0.01). Conclusion: The results suggested that the expression of CD151 was closely correlated with malignant degree of pituitary adenomas, which indicated the expression of CD151 was intimately correlated with occurrence and development of pituitary adenomas. Detecting CD151 might be a vital index to predict prognosis of pituitary adenomas.

CD151; pituitary adenomas; real time-PCR; Western blot; immunohistochemistry

安徽省自然科学基金青年项目(1408085QH169)；校重点科研项目培育基金(wk2014ZF06)；省大学生创新训练计划(AH201310368080)

2014-10-27 【修回日期】2015-02-15

R739.41

A

1000-6834(2015)02-182-004

10.13459/j.cnki.cjap.2015.02.023

△【通讯作者】Tel: 0576-84016757; E-mail: yanfangzhou@126.com