D101大孔树脂纯化大黄蒽醌组分的工艺研究

孙艳平 汪兴军 闫平 鱼霞（西安医学院，陕西 西安 710021）

大黄具有泻下攻积、清热泻火、活血化瘀等功效,现代研究表明，大黄中含有蒽醌衍生物、苷类化合物、鞣质类、有机酸、挥发油、多糖等化学成分，同时具有抗菌抗病毒、抗炎祛痰、泻下、保护胃黏膜、保肝利胆、利尿改善肾功能、降血压、降脂减肥、抗肿瘤等药理作用[1]。

目前,对大黄的活性组分离提取纯化的研究较多，如明胶沉淀法、聚酰胺法、葡聚糖凝胶法等，但这些方法操作过程复杂，处理能力有限、成本高。近年来，大孔吸附树脂技术由于操作简单、成本低等特点，在中药的提取、分离纯化方面得到了广泛的应用，不断的受到研究学者的重点关注。本实验通过研究D101树脂对大黄蒽醌类组分的吸附性能和纯化工艺，而获得较高纯度的组分，从而为大黄蒽醌类组分的分离纯化提供参考。

1 仪器、试剂与试药

1.1 仪器

Agilent 1220型高效液相色谱仪 （安捷伦科技有限公司），KQ-250B型超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司），电子天平（北京科学仪器有限公司），旋转蒸发器RE-2000A（巩义市予华仪器有限公司），SHZ-D循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限公司），电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器厂）。

1.2 试剂与试药

大黄素对照品 （中国药品生物制品检定所）；D101大孔吸附树脂；磷酸、乙醇、甲醇、盐酸、三氯甲烷（均为分析纯），色谱甲醇；水为娃哈哈纯净水；大黄药材购自西安市万寿路药材市场,经鉴定为蓼科植物唐古特大黄Pheum tanguticum Maxim.ex Balf.的干燥根及根茎。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 大黄提取液的制备

称取50g大黄粗粉，加入10倍量80%的乙醇回流提取3次，每次0.5h，滤过，合并滤液，滤液减压回收乙醇，最终得180mL浓缩液，相当于0.278g/mL的生药材。

2.1.2 供试品溶液的制备

精密量取大黄提取液0.6mL，加入8%盐酸液10mL，超声2min，再加入三氯甲烷10mL加热回流1h，放冷，置分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液层用三氯甲烷萃取3次，每次10mL，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂，残渣加甲醇溶解定容至10mL容量瓶中，即得[2]。

2.1.3 对照品溶液的制备

精密称取0.001g大黄素，用甲醇溶解后定容至10mL，制成100ug/mL的大黄素对照品溶液。

2.2 含量测定方法[3]

2.2.1 色谱条件 色谱柱：UltisIlTMXB-C18(10×250mm,5um)；流动相：甲醇-0.1%磷酸水溶液（80：20）；检测波长：254nm；流速：1mL/min；柱温：室温。在此条件下，大黄素的分离良好。

2.2.2 标准曲线的制备及线性范围的考察 分别精密吸取混合对照品溶液 4.0uL、8.0uL、10.0uL、12.0uL、16.0uL、20uL，按“2.2.1”项下色谱条件注入液相色谱仪中，记录色谱峰面积，以进样量X（ug）为横坐标，相应的峰面积A为纵坐标，绘制标准曲线，结果如下：

表-1 大黄素线性关系的实验结果

得标准曲线A=507.24X-0.4699，R=0.9998（n=6），表明大黄素在0.2ug-2.0ug范围内，线性关系良好。

2.3 大黄总蒽醌的分离与纯化工艺

2.3.1 大孔吸附树脂的预处理用适量蒸馏水漂洗，再用95%乙醇浸泡24小时，然后用蒸馏水将树脂冲洗至无醇味，用2倍于树脂体积的5%盐酸浸泡2小时，用蒸馏水冲洗至中性；再用2倍树脂体积的5%氢氧化钠浸泡2小时后用水洗至中性，备用。

2.3.2 测定静态的吸附量[4-6]取5mL预处理过的D101树脂，置100mL具塞锥形瓶中，量取10mL大黄提取液，加入锥形瓶中，每间隔30 min振荡3 min（6次），放置过夜，过滤，吸取滤液少量，对滤液和上样液进行HPLC测定大黄素含量，计算吸附量为0.4048mg/mL吸附率为80.31%。

2.3.3 测定动态的吸附量[4-6]取5mL预处理过的D101树脂，湿法装柱（20cm×1.5cm）,量取10mL大黄提取液上柱，流速1mL/min，收集流出液，用HPLC法测流出液中大黄素的含量，计算吸附量为0.3816mg/mL吸附率为72.26%。

2.3.4 上样液浓度对吸附量的影响[4-6]取4份5mL预处理过的D101树脂分别装柱（20cm×1.5cm），分别加入含生药量为0.1315、0.0658、0.044、0.0329g/mL大黄提取液各20mL，调节流速为lmL/min，分别收集流出液，用HPLC法测流出液大黄素有含量，计算吸附量和吸附率。结果见表2。

表2 上样液浓度对吸附量的影响

结果表明，在大黄提取液浓度较低时，树脂的吸附能力随着提取液浓度的降低而降低。当提取液浓度为0.0658g/mL时，吸附率最高，所以选择此浓度。

2.3.5 泄露曲线的考察[4-6]取20mL预处理过的D101树脂吸附装柱（20cm×1.5cm）,以浓度为0.0658mg/mL大黄溶液进行动态吸附，分段收集流出液，每份15mL，共收集15份，取样测定流出液中大黄素的含量。从第5份大黄素开始明显泄露，所以确定大黄提取液最大上柱体积为60mL，即3倍的树脂体积。

2.3.6 洗脱剂的选择[7]取3份20mL预处理过的D101树脂分别装柱，按上述所确定的吸附条件上样，上样结束后，分别用100mL50%、70%、90%的乙醇洗脱树脂柱，收集洗脱液，取样测定流出液中大黄素的含量，计算洗脱率；另外将洗脱液回收乙醇，干燥，称定重量，计算出膏率。

结果表明，在一定范围内，洗脱剂的浓度越高，对大黄素的洗脱能力越好，出膏率也越大，综合各因素，选用70%的乙醇为洗脱剂。

2.3.7 洗脱曲线的考察[8]取20mL预处理过的D101树脂装柱，调节流速为lmL/min，量取60mL大黄提取液上样，上样结束后，用70%的乙醇洗脱，分段收集流出液，每份20mL，共收集14份,分别取样测定流出液中大黄素的含量。前4份洗脱液中大黄素的含量经计算85%，故确定洗脱体积的用量为4倍的树脂体积。

2.4 验证试验

取3份20mL预处理过的D101树脂分别装柱，调节流速为lmL/min，分别加入60mL大黄提取液进行动态吸附，然后用10倍量的水洗至近澄清，最后各用80mL70%的乙醇以lmL/min的流速洗脱。计算D101树脂对大黄蒽醌的吸附量、吸附率、解析率、浸膏收率。结果见表-3

表-3 验证试验结果

从表-3中可以看出，D101树脂分离纯化大黄蒽醌类组分的方法稳定可行。

3 结语

D-101型大孔吸附树脂是一类苯乙烯型非极性共聚体，适用范围比较广，对于不带极性或弱极性的有机化合物，吸附能力强。大黄蒽醌类组分极性较弱，适宜选用此种分离、纯化方法。本研究中采用D101大孔吸附树脂对大黄蒽醌组分进行分离与纯化，吸附条件为:上样液浓度为0.0658g/mL，最大上样液体积为3倍树脂体积，洗脱剂为4倍量树脂体积的70%的乙醇。通过树脂的富集纯化的验证性实验，测得总蒽醌浸膏收率为13.21%，表明该树脂纯化大黄总蒽醌的工艺可行。

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