异甘草酸镁联合维拉帕米对大鼠肝切除肝缺血再灌注损伤的作用研究

陈祖兵 李蔚 沈世强 胡超 谭冠



异甘草酸镁联合维拉帕米对大鼠肝切除肝缺血再灌注损伤的作用研究

陈祖兵 李蔚 沈世强 胡超 谭冠

目的 研究异甘草酸镁(magnesium isoglycyrrhizinate，MgIG)联合维拉帕米(verapamil,异搏定)对肝切除肝缺血再灌注损伤的作用。方法 雄性SD大鼠随机分为假手术组(A组)、50%肝切除肝缺血再灌注损伤组(B组)、50%肝切除肝缺血再灌注损伤+MgIG治疗组(C组)、50%肝切除肝缺血再灌注损伤+ verapamil治疗组(D组)、50%肝切除肝缺血再灌注损伤+ MgIG联合verapamil治疗组(E组)。观察各组大鼠肝脏功能、形态学、超氧化物歧化酶(SOD)活性及FasL的表达情况。结果 与B组比较，E组病理改变明显减轻，各时间点血清丙氨酸转氨酶(ALT)水平显著下调(P<0.05)，肝组织SOD活性明显增强(P<0.05)， FasL蛋白表达明显下调(P<0.05)。结论 异甘草酸镁联合维拉帕米能有效减轻肝切除肝缺血再灌注损伤。其对肝细胞的保护作用可能是通过抑制Fas/FasL系统介导的凋亡反应，减轻肝脏过氧化损伤而实现。

异甘草酸镁；维拉帕米；大鼠；肝切除；肝缺血再灌注损伤

行复杂的肝脏外科手术时常发生肝脏缺血再灌注损伤(hepatic ischemia reperfusion injury，HIRI)，HIRI发生机制较为复杂[1-2],可造成肝细胞凋亡、坏死，是影响病人术后肝功能恢复及长期存活的重要因素。异甘草酸镁(magnesium isoglycyrrhizinate，MgIG)是一种新的肝细胞保护剂，能够抗炎并降低肝酶，有研究认为，MgIG 能够减轻CCl4导致的肝细胞损伤[3]。维拉帕米verapamil异搏定是选择性的钙离子通道阻滞剂，通过降低细胞炎症因子的水平从而减轻肝细胞损伤[4]。本文观察MgIG联合verapamil应用对大鼠肝切除肝缺血再灌注损伤保护作用的保护作用，并探讨其机制，为临床肝切除肝缺血再灌注损伤的防治提供新的思路。

材料与方法

一、材料

1.实验动物 健康雄性SD大鼠100只，体质量235～315 g,购自武汉大学实验动物中心。

2.主要试剂 异甘草酸镁注射液10 ml∶50 mg由江苏正大天晴药业股份有限公司提供，维拉帕米(verapamil，异搏定)5 mg/2 ml购自上海禾丰制药有限公司，超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。

二、方法

1.大鼠50%肝切除肝缺血再灌注损伤模型制备 实验大鼠术前12 h禁食，自由饮水。水合氯醛腹腔注射麻醉(3 ml/kg体重)，固定后消毒，取腹正中切口入腹，解剖分离肝脏韧带，充分暴露第一肝门。切除占肝体积约30%的肝左叶。以无创血管夹阻断约占肝体积50%的中叶及尾状叶血管45 min，保留占肝体积20%的肝右上、下叶作为门静脉与腔静脉之间血液回流的通道。45 min后进入腹腔移去血管夹，切除未作处理的肝右上、下叶，建立50%肝切除肝缺血再灌注损伤模型。

2.实验分组 将100只雄性SD大鼠随机分为5组: 假手术组(A组)、缺血再灌注组(B组)、MgIG组(C组)、verapamil组(D组)、MgIG+ verapamil组(E组)。每组各20只，各组按缺血再灌注时间点6 h、12 h、24 h、48 h分为4个亚组，每组5只。假手术组：仅开腹分离肝十二指肠韧带，不作肝脏切除及血管阻断，注射同容积的生理盐水。缺血再灌注组：行50%肝切除肝缺血再灌注损伤手术，注射同容积的生理盐水。MgIG治疗组：手术处理同B组，于术前30 min腹腔注射异甘草酸镁30 mg/kg。verapamil治疗组：手术处理同B组，于开腹前10 min尾静脉注射维拉帕米注射液1.25 mg/kg。MgIG+ verapamil治疗组：手术处理同B组，分别于开腹前30 min腹腔注射异甘草酸镁30 mg/kg ,术前10 min尾静脉注射维拉帕米注射液1.25 mg/kg。

3.大鼠肝功能检测 各组于实验完成后6 h、12 h、24 h、48 h抽取大鼠眼内眦静脉血，离心后取血清，送标本至武汉大学人民医院检验科，采用全自动生化分析仪检测血清丙氨酸转氨酶(ALT)水平。

4.大鼠肝组织SOD活性检测 肝组织匀浆后以黄嘌呤氧化酶法检测SOD活性，结果以每克肝组织中硝酸盐单位(NU/g)表示。

5.光镜下观察大鼠肝脏形态学变化 再灌注后12 h取肝脏组织双蒸水冲洗、脱水、透明处理、浸于石蜡包埋，做石蜡切片，进行HE染色，OLYMPUS光学显微镜于×400倍下照相，观察各组肝细胞形态学变化。

6.免疫组织化学染色检测肝组织凋亡相关基因(FasL)表达 取经甲醛固定的大鼠肝脏组织石蜡切片脱蜡染色，染色按说明书进行。在显微成像系统下(10×40倍)摄片,以Image-Pro Plus图像分析系统校正，分析测定累计吸光度及面积两参数，计算阳性表达平均吸光度。

三、统计学方法

结 果

一、光镜观察各组大鼠形态结构的改变

假手术组肝细胞排列正常，未见明显病理改变。缺血再灌注组可见肝细胞排列紊乱，大量肝细胞坏死。MgIG组、verapamil组可见肝细胞坏死减少，较缺血再灌注组病理改变减轻。MgIG+ verapamil组肝细胞无明显坏死，病理改变较MgIG组、verapamil组减轻。

二、各组大鼠血清ALT水平及肝组织SOD活性变化

如图1所示，MgIG+ verapamil联合用药能明显降低肝切除肝缺血再灌注损伤大鼠血清ALT水平，缺血再灌注组、MgIG组、verapamil组、MgIG+ verapamil组相比于假手术组，各时间点血清ALT水平于肝切除肝缺血再灌注后均明显增高(P<0.05)，且均在再灌注24 h达到高峰。术后6 h、12 h、24 h、48 h, MgIG组、verapamil组、MgIG+ verapamil组ALT水平均明显低于缺血再灌注组组(P<0.05)，MgIG+ verapamil组ALT水平分别明显低于MgIG组、verapamil组(P<0.05)。

如图2所示，MgIG+verapamil联合用药能明显增强肝切除肝缺血再灌注损伤大鼠肝组织SOD活性。术后6 h，缺血再灌注组、MgIG组、verapamil组、MgIG+verapamil组SOD活性均明显低于假手术组(P<0.05)，MgIG组、verapamil组SOD活性明显高于缺血再灌注组(P<0.05)，MgIG+verapamil组SOD活性明显高于MgIG组、verapamil组(P<0.05)。

图1 大鼠血清ALT水平

※与假手术组相比,分别t=10.03,8.09,7.77,4.71,※P<0.05;#与缺血再灌注组相比,分别t=3.82,4.02,8.88,#P<0.05;△与MgIG组相比,t=5.59,△P<0.05,△与verapamil组相比,t=5.00,△P<0.05图2 大鼠肝组织SOD活性

三、免疫组织化学检测各组大鼠肝组织FasL蛋白的表达

以观察到细胞质棕黄色染色为FasL的表达阳性。假手术组未见明显FasL阳性染色，缺血再灌注组可见细胞胞质呈弥漫性强阳性染色，阳性染色明显强于假手术组，MgIG组、verapamil组、MgIG+ verapamil组Fasl阳性染色明显弱于缺血再灌注组，但仍然强于假手术组，MgIG+ verapamil组阳性染色明显弱于MgIG组、verapamil组。见图3、4。

※与假手术组相比,分别t=11.40,6.15,7.82,6.60,※P<0.05;#与缺血再灌注组相比,分别t=5.53,5.57,8.69,#P<0.05;△与MgIG组相比,t=2.83,△P<0.05,△与verapamil组相比,t=3.71,△P<0.05图4 FasL阳性表达平均吸光度

讨 论

肝脏在正常的生理状况下具有强大的再生能力，行肝大部切除后残肝能迅速的恢复功能及体积[5]。然而在临床上行肝大部切除的病人常常合并肝硬化、肝癌等，肝功能储备差，肝损伤后再生能力下降，再加上肝切除后缺血再灌注损伤，常导致术后肝功能不全，甚至出现肝衰竭[6]。因此，寻找一种有效的减轻肝脏损伤、促进术后残肝功能恢复的措施是很有必要的。目前减轻肝脏缺血再灌注损伤的措施主要包括缺血预处理、药物预处理等，有研究认为药物预处理的效果及应用前景优于缺血预处理[7-8]。

异甘草酸镁为新一代肝细胞保护剂，是甘草酸的异构体。具有保护细胞膜、抗炎、抗凋亡、抗氧化等作用。有研究表明，异甘草酸镁可减轻由Fe-NTA引起的肝星状细胞氧化损伤,可能有助于肝纤维化的治疗[9]。另有研究显示，异甘草酸镁可减低肝切除术后急剧增高的肝酶[10]。维拉帕米为罂粟碱的衍生物，是一种电依赖的脂溶性钙离子拮抗剂，一般于静脉注射10 min后达到高峰，可阻滞血液中钙离子进入肝细胞，减轻细胞钙超载，从而起到保护肝细胞的作用[11-12]。本研究结果显示，肝切除肝缺血再灌注损伤导致肝脏形态学损伤，血清ALT水平明显上调，分别用异甘草酸镁及维拉帕米治疗后肝脏形态学损伤明显减轻，ALT水平明显下调，联合用药后肝脏形态学损伤较分别单独用药进一步减轻，ALT水平明显下调。这表明异甘草酸镁联合维拉帕米疗效较单用药好，能有效改善肝脏功能，对肝脏起到协同保护作用。

A:假手术组;B:缺血再灌注组;C:MgIG组;D:verapamil组;E:MgIG+verapamil组图3 免疫组织化学检测肝组织FasL蛋白的表达(免疫组织化学染色,×400)

缺血再灌注损伤后可有大量的活性氧(ROS)生成[13], 新生成的ROS可进一步促进线粒体内ROS的生成，ROS具有强氧化作用，引起肝脏发生脂质过氧化反应，产生MDA等毒性产物破坏生物膜结构、损伤线粒体内呼吸链酶复合体，最终导致细胞肿胀和死亡。超氧化物歧化酶(SOD)作为内源性抗氧化酶，能清除氧自由基，对抗机体过氧化损伤,是反映机体抗氧化能力的指标[14]。本研究结果显示，肝切除肝缺血再灌注损伤后肝组织SOD活性明显下降，分别用异甘草酸镁及维拉帕米治疗后肝组织SOD活性明显增强，联合用药后SOD活性进一步增强，表明肝切除肝缺血再灌注损伤时肝脏抗氧化能力下降，联合用药有助于增强机体抗氧化能力，减轻肝脏过氧化损伤，从而起到保护作用。

肝细胞凋亡是许多肝脏疾病的共同的病理学表现，研究显示肝细胞凋亡在非酒精性脂肪肝、肝纤维化甚至是肝硬化及肝癌的发生、发展中起着关键作用[15]。死亡受体通路是调控肝细胞凋亡的主要通路之一，Fas参与死亡受体信号通路，是一种属于TNF超家族成员的跨膜蛋白，在细胞凋亡的信号传导过程中发挥作用。FasL与Fas相结合组成Fas/FasL系统，通过诱发凋亡信号的转导，最终激活凋亡效应分子Caspase-3，作用于细胞的结构蛋白，从而导致细胞凋亡[16]。本实验结果显示，肝切除肝缺血再灌注损伤后FasL蛋白表达水平明显上调。分别用异甘草酸镁及钙离子拮抗剂治疗后FasL蛋白水平明显下调。联合用药后Fasl蛋白表达水平进一步下调，提示肝切除肝缺血再灌注损伤时肝脏存在由Fas/FasL系统介导的细胞凋亡,联合应用异甘草酸镁及维拉帕米可能通过降低FasL表达，减少Fas与FasL的结合，减少Caspase-3激活，从而减少肝细胞凋亡。

综上所述，本研究结果表明，异甘草酸镁联合维拉帕米对肝切除肝缺血再灌注损伤的效果优于单用药，能有效减轻肝切除肝缺血再灌注损伤。其对肝细胞的保护作用可能是通过抑制Fas/FasL系统介导的细胞凋亡反应，增强机体抗氧化能力，减轻肝脏过氧化损伤而实现的。但其具体机制仍需进一步实验研究。

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Effects of magnesium isoglycyrrhizinate and verapamil on rat liver during ischemia-reperfusion injury after semi-hepatectomy

ChenZubing,LiWei,ShenShiqiang,HuChao,TanGuan.

DepartmentofHepatobiliarySurgery,RenminHospital,WuhanUniversity,Wuhan430060,China

ChenZubing,Email:chenzubing@aliyun.com

Objective To explore the effects of isoglycyrrhizinate and verapamil on rat liver during ischemia-reperfusion injury after semi-hepatectomy .Methods Male Sprague-Dawley rats were randomly divided into 5 groups of sham-operation (A); 50% hepatectomy plus 45-min hepatic ischemia (B); isoglycyrrhizinate treatment (C); verapamil treatment (D); isoglycyrrhizinate & verapamil treatment (E). The morphology of liver tissues was observed. And the plasma levels of alanine aminotransferase (ALT) and superoxide dismutase (SOD) and the FasL expression in liver tissue were measured.Results Compared with group B, the pathological changes were milder, the serum level of ALT decreased significantly (P<0.05), SOD activity increased in liver tissue (P<0.05) and FasL protein expression declined significantly in group E.Conclusions Isoglycyrrhizinate and verapamil have protective effects against ischemia-reperfusion injury after liver resection. And the protective effects may be mediated by an inhibition of apoptosis caused by Fas/FasL system and blunted liver peroxidation damage.

Isoglycyrrhizinate; Verapamil; Rats; Liver resection; Liver ischemia-reperfusion injury

·论 著·(实验研究)

中国肝炎防治基金会-天晴肝病研究基金资助课(CFHPC20132117)

430060 武汉，武汉大学人民医院肝胆腔镜外科

陈祖兵,Email: chenzubing@aliyun.com

R657.4+6

A

10.3969/j.issn.1003-5591.2015.02.014

2014-11-03)