脂肪酸酰胺水解酶抑制剂URB597诱导人肝癌细胞MHCC97H凋亡的作用及其机制研究

杨 锐，周 佳，李 方，张 春，卜书红（上海交通大学医学院附属新华医院药学部，上海 200092）

脂肪酸酰胺水解酶抑制剂URB597诱导人肝癌细胞MHCC97H凋亡的作用及其机制研究

杨 锐，周 佳，李 方，张 春，卜书红*（上海交通大学医学院附属新华医院药学部，上海 200092）

目的：观察脂肪酸酰胺水解酶（fatty acid amide hydrolase，FAAH）抑制剂URB597诱导人肝癌高转移细胞MHCC97H凋亡的作用，并探讨其机制。方法：给予不同浓度（1、5、10μmol/L）URB597与MHCC97H孵育，应用流式细胞仪检测细胞凋亡率。采用蛋白质印迹技术检测凋亡诱导因子（apoptosis inducing factor，AIF）在细胞核中的水平，及凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达水平。采用caspase 3试剂盒检测caspase 3的活性变化。结果：（1）不同浓度（1、5、10μmol/L）URB597作用细胞1、4、7d后，凋亡细胞数目明显增加，呈时间-剂量依赖性；（2）不同浓度URB597作用96h后细胞内caspase 3活性明显升高，且细胞核中AIF水平显著增加；（3）10μmol/L URB597作用细胞96h后，与对照组相比，Bcl-2水平明显下调，Bax水平明显上调，Bcl-2/Bax比值显著下降。PI3K抑制剂LY294002亦可显著降低Bcl-2/Bax比值，但与10μmol/L URB597作用相比，对Bcl-2/Bax比值的影响程度较低。结论：URB597可通过促进人肝癌细胞凋亡抑制其增殖，该作用与其下调Bcl-2/Bax比值，影响线粒体通透性，诱导caspase依赖和非caspase依赖的细胞凋亡有关，且部分依赖于PI3K/Akt通路。

脂肪酸酰胺水解酶抑制剂；URB597；肝癌细胞MHCC97H；细胞凋亡；PI3K/Akt信号通路

［Pharm Care Res，2015，15（4）：261-264］

肝细胞癌（hepatocellular cancer，HCC，简称肝癌）具有发病率高、致死率高的特点，居我国恶性肿瘤死亡率第二位。手术切除仍是治疗肝癌最有效的方法，但即使根治切除术后，其转移复发率仍有60%～70%。因此，寻找有效的、新的术后药物治疗是肝癌治疗亟待解决的重要问题。

内源性大麻素——N-花生四烯酸氨基乙醇（anandamide，AEA）属于脂质信号分子。大量研究发现，AEA对包括肝癌在内的多种肿瘤具有抑制增殖、抑制黏附和侵袭、抑制肿瘤血管生成以及诱导凋亡等作用［1］。但由于AEA体内可被位于细胞质中的水解酶——脂肪酸酰胺水解酶（fatty acid amide hydrolase，FAAH）迅速代谢，外源性补充AEA作用效果微弱且短暂，不具有成药性［2］。URB597（化学结构见图1）是AEA代谢酶的选择性抑制剂，可上调AEA水平，对黑素瘤、神经胶质细胞瘤、前列腺癌均有显著抑制作用［3-5］。前期研究发现，URB597可抑制人肝癌高转移细胞系MHCC97H的增殖［6］，但其机制仍需进一步探索。本研究以MHCC97H细胞为靶细胞，通过体外实验，深入探讨URB597诱导人肝癌细胞凋亡的作用及机制。

1 材料和方法

1.1 材料 DMEM高糖培养基和0.125%胰酶（美国GibcoBRL公司）；URB597、一抗Bcl-2、Bax、凋亡诱导因子（apoptosis-inducing factor，AIF）及羊抗兔二抗（美国Cell Signaling Technology公司）；CCK-8细胞增殖试剂盒和caspase 3活性检测试剂盒（碧云天生物科技有限公司）。

1.2 细胞培养 MHCC97H细胞是具有高转移潜能的人肝癌细胞株（中国科学院上海细胞库），采用含10%胎牛血清（FBS），青霉素200IU/ml、链霉素200IU/ml的DMEM高糖培养基于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养，密度至80%按1:3传代。

1.3 流式细胞仪检测细胞凋亡 AnnexinⅤ-FITC/PI是定量检测凋亡的快速、灵敏的方法。实验结束后，用0.125%胰酶消化细胞，小心吹打细胞，211×g离心1min。弃去培养液，PBS 90μl重悬，收集1×105个细胞，同时加入AnnexinⅤ-FITC 5μl和PI 4μl（美国BD pharmingen公司），在闭光条件下孵育15min，再加100μl PBS重悬，流式细胞仪检测，激发光波长为488nm，发射光波长分别为520、575nm。

1.4 Caspase 3活性检测 药物作用结束后，吸取细胞培养液备用，用胰酶37℃消化细胞45s，收集并离心，去除上清液，并用PBS洗涤一次，按比例加入裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解15min。分别加入冰浴的pNA和Ac-DEVD-pNA（2mmol/L），混匀，避免产生气泡，并设置空白对照组。37℃孵育2h后，在405nm测定吸光度（A），样品的A405与空白对照的A405差值即为样品中caspase 3催化产生的pNA产生的吸光度。将差值代入已做好的pNA标准曲线就可以计算出caspase 3的活性。

1.5 蛋白质印迹法 药物处理结束后弃去培养液，加入适量蛋白裂解液，收集至预冷1.5ml离心管中；4℃1.34×104×g离心20min，取上清，二喹啉甲酸法（BCA法）检测蛋白质浓度，100℃蛋白质变性5min。制备聚丙烯凝胶，60V电泳至分离胶，电压转至80V继续电泳2h。冰浴转膜：100V1～2h。用5%脱脂奶粉室温下封闭1h；加一抗Bcl-2杂交，PBST洗膜3次；加羊抗兔二抗杂交，PBST洗膜3次。蛋白质印迹的核蛋白内参选用Lamin A蛋白，胞浆蛋白内参选用GAPDH。采用增强化学发光（ECL）试剂显影，Las3000曝光机曝光。曝光后，利用Quantity One软件（Bio-Rad公司）测算各蛋白质印迹的灰度值，进而计算蛋白质表达量之间的比值。

2 结 果

2.1 URB597促进MHCC97H细胞凋亡的作用 1、5、10μmol/L URB597分别与MHCC97H细胞孵育1～7d后，采用AnnexinⅥ/PI染色，经流式细胞仪检测发现，5、10μmol/L URB597作用4d，可诱导MHCC97H细胞凋亡率升高，而1μmol/L URB597作用7d可诱导MHCC97H细胞凋亡率升高，提示URB597促进MHCC97H细胞凋亡呈时间-剂量依赖性（见表1）。

表1 3种浓度URB597作用不同时间对MHCC97H细胞凋亡率的影响Table 1 The effects of 3concentrations of URB597on the apoptosis of MHCC97Hcells at different time points

2.2 URB597对不同凋亡途径的影响 Caspase 3是caspase依赖的细胞凋亡途径中的关键分子［7］，AIF是非caspase依赖的凋亡途径中的关键分子［8］。与对照组相比，5、10μmol/L URB597作用96h后，用药组caspase 3活性显著升高，细胞核内AIF水平显著增加，而1μmol/L URB597作用96h后caspase 3活性及核内AIF水平均无明显变化，提示5、10μmol/L URB597作用96h后可诱导caspase依赖及非caspase依赖的细胞凋亡，见图2。

图2 3种浓度URB597作用96h后对不同凋亡通路的影响Figure 2 The effects of 3concentrations of URB597 on different apoptotic pathways after 96h

2.3 URB597对Bcl-2/Bax表达的影响 Bcl-2/Bax平衡可通过影响线粒体的功能，参与caspase家族的活化及AIF的释放，影响细胞凋亡的进程，在细胞凋亡的病理过程中起重要作用。与对照组比较，作用96h后，10μmol/L URB597组凋亡蛋白Bax表达明显增加，其蛋白灰度值比对照组灰度值增加了1.7倍（P＜0.05，n＝3）；抗凋亡蛋白Bcl-2的表达明显减少，其蛋白灰度值下降至对照组的45%（P＜0.05，n＝3）（见图3），提示URB597促进细胞凋亡与其调节Bcl-2/Bax平衡有关。此外，给予PI3K抑制剂LY294002，发现其亦可上调Bax，下调Bcl-2水平，但其作用强度低于URB597。与对照组比较，作用96h后，5μmol/L LY294002组凋亡蛋白Bax表达增加1.3倍（P＜0.05，n＝3）；而Bcl-2的表达下降了50%（P＜0.05，n＝3）。

3 讨 论

本研究结果发现，URB597可通过诱导肿瘤细胞凋亡从而抑制其增殖，且具有明显的时间及剂量依赖性，1μmol/L URB957作用7d及5、10μmol/L URB957作用4、7d，MHCC97H细胞凋亡率明显升高。在对其促凋亡机制的研究中，发现5、10μmol/L URB597作用96h后，caspase 3活性显著升高，细胞核中AIF水平明显增加。Caspase 3和AIF分别是caspase依赖和非caspase依赖的细胞凋亡途径中的关键分子，caspase 3活化后可在细胞内进行蛋白质剪切及降解；AIF进入细胞核，可导致DNA大片段断裂，均可导致细胞凋亡［7］。所以，URB597H可能诱导MHCC97H细胞同时发生caspase依赖和非caspase依赖的细胞凋亡。

图3 URB597及LY294002作用96h对Bcl-2和Bax表达水平的影响Figure 3 The effects of URB597and LY294002 on the expression levels of Bcl-2and Bax after 96h

Bcl-2家族属于凋亡相关蛋白，通过其抗凋亡和促凋亡成员的协同作用，发挥着细胞凋亡开关的作用。当细胞发生凋亡时，Bax可以与线粒体结合，导致线粒体损伤，使caspase 3活化及AIF释放。抗凋亡分子Bcl-2则可阻止Bax在线粒体上形成转换孔，进而发挥抗凋亡作用。Bcl-2大量表达可以对抗Bax的促凋亡活性，而Bax的大量表达则可阻断Bcl-2抗凋亡的活性［8］。Bcl-2家族蛋白表达可受多条信号通路调控，如PI3K通路等［10］。研究发现，PI3K通路在大多数肿瘤中均保持在高活化水平，且多种化疗药的抗肿瘤机制与阻断该通路有关［10，11］。本研究结果显示，与对照组相比，10μmol/L URB597作用96h后Bax水平明显升高，Bcl-2水平明显下降，提示URB597可能通过影响Bcl-2/Bax的平衡，导致线粒体损伤，进而诱导caspase 3活化及AIF释放。此外，与对照组相比，PI3K抑制剂LY294002同样导致了Bax水平升高，Bcl-2水平下降，打破了Bcl-2/Bax平衡，该结果与相关文献报道一致；但与10μmol/L URB597相比，LY294002对Bax与Bcl-2水平的影响相对较弱，提示URB597对Bax与Bcl-2水平的影响并不完全依赖PI3K通路。前期研究显示，URB597可以抑制PI3K/Akt通路，可能与其抑制肿瘤细胞生长及侵袭有关。结合本研究结果提示，URB597影响Bax和Bcl-2表达水平，进而促进肝癌细胞凋亡，可能与其抑制PI3K/Akt通路有关，但并不完全依赖于该通路。

综上所述，本研究结果表明，URB597可通过改变Bcl-2/Bax平衡，诱导线粒体损伤，使caspase 3活化，核内AIF水平增加，最终启动caspase依赖及非caspase依赖的细胞凋亡，且该作用可能与其抑制PI3K/Akt通路有关。

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Effects of fatty acid amide hydrolase inhibitor URB597 on apoptosis of human hepatoma cell line MHCC97H and its underlying mechanism

YANG Rui，ZHOU Jia，LI Fang，ZHANG Chun，BU ShuHong*
（Department of Pharmacy，Xinhua Hospital Affiliated to School of Medicine，Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200092，China）

Objective：To discuss the effects of fatty acid amide hydrolase inhibitor URB597on the apoptosis of human hepatoma cell line MHCC97Hin vitroand its underlying mechanism.Methods：Different concentrations of URB597（1，5and 10μmol/L respectively）were administered to incubate MHCC97H. Flow cytometry was used to analyze the effects of URB597 on apoptosis in MHCC97Hcells. Western-blot assay was applied to detect the levels of the apoptosis-inducing factors（AIF），Bcl-2and Bax with or without URB597. Caspase 3detection kit was used to determine the activity of caspase 3.Results：（1）Following treatment with URB597at different concentrations（1，5and 10μmol/L）for 1，4and 7days，the number of apoptotic cells was significantly increased with a time-dependent tendency. （2）After treatment with URB597at different concentrations for 4days，the activity of caspase 3and AIF levels in the nucleus were increased significantly. （3）Following treatment with URB597at a concentration of 10μmol/L for 4days，the expression level of Bcl-2was obviously down-regulated，while Bax level was obviously up-regulated，when compared with those of the control group，and the Bcl-2/Bax ratio was obviously reduced. PI3Kinhibitor LY294002could also significantly reduce the Bcl-2/Bax ratio. However，as compared with the 10μmol/L control level，its effect on the Bcl-2/Bax ratio was relatively lower.Conclusion：URB597could enhance the apoptosis of MHCC97Hcells by down-regulating the ratio of Bcl-2/Bax，further inducing caspase-dependent and caspase-independent cell apoptotic pathway，which was partial-dependent on PI3K/Akt signal pathway.

fatty acid amide hydrolase inhibitor；URB597；hepatoma cell line MHCC97H；cell apoptosis；PI3K/Akt signal pathway

R965，R979.1 ［

］ A ［

］ 1671-2838（2015）04-0261-04

10.5428/pcar20150408

2015-01-21

］ 2015-07-20

上海交通大学医学院附属新华医院院基金（13YJ18）

杨 锐（女），博士，药师.

E-mail：yangr.2007@163.com

卜书红，E-mail：sophia5237@126.com

［

［本文编辑］吴铭权