CRF2受体拮抗剂Astressin2B减轻葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠实验性结肠炎

杨 丽，郑鹏远，于 泳

（1.郑州人民医院消化内科，河南郑州 450002;2.郑州大学第二附属医院消化科，河南郑州 450002）

CRF2受体拮抗剂Astressin2B减轻葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠实验性结肠炎

杨 丽1，郑鹏远2*，于 泳2

（1.郑州人民医院消化内科，河南郑州 450002;2.郑州大学第二附属医院消化科，河南郑州 450002）

*通信作者（corresponding author）:mdep7123@126.com

炎性肠病的研究多集中在遗传、免疫及微生物等方面，近年发现神经肽也参与该病发生，其中促肾上腺皮质激素释放因子（corticotrophin-releasing factor，CRF）不仅在脑组织中存在，周围组织也有表达，后者与炎性反应发生有关［1］，溃疡性结肠炎肠道炎性组织中CRF的表达增高，CRF基因敲除小鼠或CRF2受体缺陷小鼠肠道炎性反应减轻［2］，提示周围型CRF信号系统活化与肠道炎性的发生有关，Astressin2B是一选择性的CRF2受体拮抗剂，因其不通过血-脑脊液屏障，可以保证其对肠黏膜的局部作用，而不影响中枢组织的CRF2受体，本实验观察Astressin2B对肠道炎性反应改善作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 SPF级Balb/C小鼠，雌性，6～7周龄，15～18 g［郑州大学动物实验中心，动物合格证号scxk（豫）2005-0001］，兔抗鼠 TLR4、NF-κBp65 多克隆抗体（Santa 公司），葡聚糖硫酸钠（DSS）和 Astressin2B（Sigma公司）;TNF-α、IL-1β和IL-6ELISA试剂盒（上海西唐生物公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及模型制备:实验分为对照组、DSS组和Astressin2B组，每组8只。建立DSS结肠炎小鼠模型，给DSS组和Astressin2B组小鼠每日饮用5%DSS（W/W）溶液，共7 d。Astressin2B组小鼠每日按30 μg/kg皮下注射Astressin2B。

1.2.2 DSS结肠炎评价:每日观察小鼠的体质量、大便性状和隐血情况，对小鼠疾病活动指数（disease activity index，DAI）进行评估。7 d后观察结肠大体形态，对结肠大体形态评分（gross morphological score，GMS）和组织学评分（histological score，HS）。

1.2.3 比色法测定结肠组织髓过氧化物酶（MPO）。

1.2.4 Western blot检测 TLR4 和 NF-κB P65。

1.2.5 ELISA检测组织上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6水平。

2 结果

2.1 各组小鼠DAI评分:DSS组小鼠出现不同程度的懒动、厌食、竖毛、消瘦、腹泻和便血，与DSS组比较，Astressin2B组小鼠症状明显减轻（图1），DAI评分见图2。

图1 各组小鼠体质量变化Fig 1 Weight change of mice in each group

图2 各组小鼠疾病活动指数Fig 2 The disease activity index of mice in each group

2.2 各组小鼠大体评分、组织学评分及MPO活性:DSS组小鼠肠黏膜组织可见充血、水肿、散在糜烂和溃疡，镜下见隐窝炎，腺体排列紊乱变形，炎性细胞浸润密集。而Astressin2B组小鼠肠黏膜炎性反应程度较DSS组明显轻微;MPO活性也下降（图3和表1）。

2.3 Western blot结果测定（图4和表1）。

图3 各组小鼠肠黏膜组织学变化Fig 3 Histological change of mice colon in each group（×200）

表1 各组小鼠大体和组织学评分、MPO活性、炎性因子、TLR4和NF-κB测定Table 1 The value of general form score，histological score，activity of MPO，TLR4 and NF-κB in each group（x ± s，n=8）

图4 各组小鼠肠组织中TLR4和NF-κB的蛋白表达Fig 4 The protein expressions of TLR4 and NF-κ B in mice colon in each group

2.4 ELISA检测结果见表1。

3 讨论

周围组织中的CRF致炎作用已逐渐引起人们的注意，控制周围组织中的CRF信号系统活化有可能成为减轻炎性反应的新靶标。本研究前期体外发现在肠上皮细胞中CRF通过CRF2受体通路激活TLR4信号系统［3］。因此拟通过类似人类溃疡性结肠炎的DSS结肠炎模型，观察体内能否通过Astressin2B阻断CRF2受体信号通路，减少CRF活化来减轻肠道炎性反应。本结果显示Astressin2B组小鼠质量变化、DAI评分、大体评分、组织学评分虽高于正常组，但是较之DSS组明显降低;反映结肠炎性反应程度的MPO的活性在Astressin2B组虽高于正常对照组，但较DSS组也明显降低。提示在DSS诱导结肠炎的过程中Astressin2B能有效的减轻肠道炎性反应。

为了明确Astressin2B减轻肠道炎性反应的机制，进一步检测了TLR4和NF-κB的表达情况。肠黏膜对腔内微生物的免疫稳定与肠黏膜组织中的Toll样受体（TLR）密不可分，其中TLR4是调节这种免疫平衡最重要的受体，TLR4活化可导致肠黏膜对腔内微生物异常反应，激活NF-κB信号系统，导致大量促炎因子的释放，进而引起肠黏膜损伤，也是炎症性肠病发病的一个重要原因［4］。

本研究显示Astressin2B组中的TLR4及NF-κB表达明显低于DSS组，TNF-α、IL-1β和 IL-6亦明显低于 DSS组。这就提示Astressin2B对DSS诱导的实验性结肠炎的保护作用可能与体内阻断TLR4/NF-κB信号通路，减少促炎因子TNF-α、IL-1β和 IL-6的释放有关。

［1］ Papathanasiou E，Palaska I.Theoharides TC.Stress hormones regulate periodontal inflammation.［J］.Biol Regul Homeost Agents，2013;27:621-626.

［2］Kokkotou E，Torres D，Moss AC，et al.Corticotropin-releasing hormone receptor 2-deficient mice have reduced intestinal inflammatory responses.［J］.J Immunol，2006，177:3355-3361.

［3］杨丽，郑鹏远、刘志强、等，促肾上腺皮质释放因子对HT-29细胞中 Toll样受体4/核因子-κB信号通路的影响［J］.中华消化杂志，2011，09:609-612.

［4］Geremia A，Biancheri P，Allan P，et al.Innate and adaptive immunity in inflammatory bowel disease.［J］.Autoimmun Rev，2014;13:3-10.

R574

A

10.16352/j.issn.1001-6325.2015.09.027

1001-6325（2015）09-1264-03

2015-01-06

2015-04-28

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