超临界CO2萃取杜仲叶总黄酮工艺研究

◎王华芳

（三门峡职业技术学院食品园林学院，河南三门峡472000）

超临界CO2萃取杜仲叶总黄酮工艺研究

◎王华芳

（三门峡职业技术学院食品园林学院，河南三门峡472000）

以杜仲叶为原料，研究了超临界CO2萃取杜仲叶总黄酮的工艺条件，并以总黄酮提取率为指标，通过设计L9（33）正交试验研究了萃取温度、压强和时间对超临界CO2萃取杜仲叶总黄酮的影响。结果表明：三因素对提取率的影响顺序为压强＞温度＞时间，最佳提取工艺条件为温度50℃，压强30MPa，时间120min。同时按照最佳工艺参数进行验证提取，提取率高达10.55%。

超临界CO2；萃取；杜仲叶；总黄酮

杜仲是一种名贵的中药材，蕴含有丰富的天然活性物质，如木脂素类、多糖、有机酸、黄酮类化合物等，具有补肝肾，强筋骨，安胎，降压等作用[1]。杜仲叶同杜仲皮成分基本一致，含有丰富的黄酮类化合物，该类物质是杜仲药效的主要活性成分之一，具有扩张冠状血管、促进血液循环、抗炎、抗病毒、抗癌、保肝利水、美容美发及祛斑等功效[2-5]，目前已经应用于功能性保健品的研发中。

河南省灵宝市是中国现存的杜仲的唯一原产地，杜仲资源相当丰富，占全世界杜仲产量的99.9%以上。目前三门峡市从事关于杜仲深加工开发利用的企业颇多，其研制开发的杜仲系列保健产品具有市场销路好、经济效益高等特点。但是，在前期调研中我们发现，这些企业科研技术上还存在杜仲资源利用率偏低、后期处理难度大等问题，因此本着服务地方企业科研需求的理念，我们尝试寻求一种更高效、环保的技术来提高杜仲叶总黄酮萃取率。

目前关于杜仲有效物质的提取方法主要有水蒸气蒸馏法、有机溶剂萃取法、微波提取法和超声波辅助萃取[6-10]等。超临界CO2流体萃取技术是近年来发展起来的一种新型萃取技术，具有提取率高、中药有效成分不被破坏、操作温度低，无有机溶剂残留、工艺简单等优点，目前被广泛应用在中草药有机成分萃取研究中，如李作梅[11]等研究了其在竹叶中总黄酮的萃取技术。

笔者利用超临界CO2萃取技术开展杜仲叶次生代谢物总黄酮提取研究,在实验中，我们以总黄酮含量为考察指标，通过单因素和正交试验，优化杜仲叶中总黄酮提取工艺，确定了最佳工艺条件，为杜仲药用资源的开发和利用提供实际参考价值。

1 实验部分

1.1 实验材料和试剂

杜仲叶采于河南省灵宝市，洗净、烘干、粉碎过40目筛后备用；芦丁标准品，中国药品生物制品鉴定所；无水乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝等均为分析纯；

1.2 主要仪器

FA604A电子天平，上海精天电子仪器有限公司；722型紫外可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；超临界CO2萃取仪HA120-50-01型超临界萃取装置；中兴高速万能粉碎机，北京中兴伟业仪器有限公司；电热恒温干燥箱，上海沪升实验仪器厂。

1.3 实验方法

1.3.1 杜仲叶总黄酮的萃取

准确称取粉碎后的杜仲叶原料10g放入萃取釜，将20mL无水乙醇夹带剂泵入萃取釜中，设定温度、压力和萃取时间，通入CO2进行萃取，萃取结束后收集提取液，测定其总黄酮浓度。

以总黄酮含量为考察指标，设计单因素实验，分别考察萃取温度、萃取压力和萃取时间对黄酮提取率的影响，同时，在单因素实验的基础上设计三因素三水平9次正交实验，预测并验证超临界CO2流体萃取总黄酮的最佳工艺条件。

1.3.2 杜仲叶总黄酮含量的测定

本实验采用分光光度法[12]测定总黄酮的含量，并计算其含量。

1.3.2.1 芦丁标准曲线绘制

精密称取20mg芦丁标准品，以无水乙醇溶液定容于25mL容量瓶中,作为对照溶液。准确吸取标准品溶液1，2，3,4,5mL置于10mL容量瓶中，分别加入1mL5%的NaNO2溶液，1mL10%硝酸铝溶液，4mL%NaOH溶液，以上三种溶液每一样加入之后均摇匀静置5min，最后用无水乙醇溶液定容至刻度线，混匀放置15min后，备用。对标液进行全波长扫描，找出最大吸收波长。以吸光度值为纵坐标，浓度为横坐标，建立芦丁标准曲线。

1.3.2.2 杜仲叶总黄酮含量计算

测量提取液吸光度值A，将其代入线性回归方程，计算出总黄酮的浓度。总黄酮物质的含量按下式计算：

其中Y为黄酮提取率，C为提取液中黄酮浓度mg/mL，V为提取液体积mL,W为原料重量mg。

2 结果与讨论

2.1 测量波长选择

以无水乙醇溶液为参比，对提取液进行全波长扫描，如图1所示，吸光度值在波长505nm处有强烈吸收，且峰形平缓，符合最大吸收波长选择的条件，因此选择505nm为测量波长。

2.2 标准曲线绘制

以无水乙醇溶液参比，按照1.3.2.1方法配制系列不同浓度的芦丁溶液，并测量其吸光度值，同时以吸光度值为纵坐标，浓度为横坐标，建立芦丁标准曲线，见下图2，拟合线性回归方程为：A= 0.6841⋆C+0.1881，R2=0.9939，线性关系良好。

2.3 单因素实验

2.3.1 萃取温度对提取率的影响

准确称取10g杜仲叶粉末5份，分别加入20mL无水乙醇夹带剂，设定压力30MPa,萃取时间90min，分别考察温度在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃的萃取率。

由图3可知，当压强和萃取时间固定后，随着温度的升高，提取率呈现先上升后下降的趋势，并且在55℃下达到最高值，这可能是随着温度的升高，黄酮溶解度增加，之后由于温度过高，导致CO2流体密度降低所致，因此选择55℃下萃取是比较合适的。

2.3.2 萃取压力对提取率的影响

准确称取10g杜仲叶粉末5份，分别加入20mL无水乙醇夹带剂，设定温度55℃,萃取时间90min，分别考察压力在20MPa、25MPa、30MPa、35MPa、40MPa的萃取率，结果见图4。

在20MPa～30MPa区间时，黄酮提取率随着压强的增大迅速上升，主要是由于压力增大，CO2流体与溶质之间的渗透增大，有利于萃取。当压强过高时，提取率增幅平缓，基本保持不变，这可能是由于高压下CO2的可压缩性小，进而无法增大其溶解力所致。另外，从设备安全性角度考虑，压强也不能太高。因此，压强取30MPa比较合适。

2.3.3 萃取时间对提取率的影响

准确称取10g杜仲叶粉末5份，分别加入20mL无水乙醇夹带剂，设定温度55℃,压力MPa，分别考察萃取时间在30min、60min、90min、120min、150min下的萃取率，结果见图5。

由图五可知，萃取时间对提取率影响显著，随着萃取时间的延长提取率显著上升，这主要是增加了溶剂溶质接触的时间，有利于萃取完全。但是当萃取时间超过一个小时后增幅减缓，可能是由于剩余杜仲叶中总黄酮较少，杂质较多，导致提取率减少，因此，从提高效率和节约资源的角度，选择90min比较合适。

图1 芦丁全波长扫描曲线

图2 标准曲线八绘制

图3 温度对总黄酮提取率的影响

图4 萃取压力对黄酮提取率的影响

图5 萃取压力对黄酮提取率的影响

2.4 正交及验证实验

在单因素实验的基础上，以总黄酮提取率为指标，选择萃取温度、压强和时间三因素进行三水平9次试验，找到最佳提取工艺条件,正交试验因素水平表见表1，直观分析表见表2。

由直观分析表可知，三因素对提取率的影响顺序为B＞A＞C，即压强对提取率影响最大，其次是温度，最后是时间，最佳提取工艺条件为A1B2C3，即萃取温度50℃，萃取压强30MPa,萃取时间120min。与单因素实验相比较，压强取值同单因素实验一致，温度由单因素实验中的55℃降低到了50℃，而萃取时间则有90min延长到了120min,也就是说通过延长时间来弥补温度降低所造成的提取率下降，这样在保证提取率的前提下，不仅可以降低温度过高对设备的损耗，还可以降低成本，完全有利于工业化生产。

按照正交优化最佳实验体系进行验证试验，测得总黄酮提取率为10.55%，是所有试验中提取率最高的，进一步验证了正交优化实验条件的可靠性。

表1 L9（33）正交试验因素水平表

表2 L9（33）正交试验直观分析表

3 结论

通过单因素实验和正交试验可知，超临界CO2萃取技术能够很好地完成杜仲叶中总黄酮的提取，在萃取温度50℃，萃取压强30MPa,萃取时间120min的条件下，萃取效率最高。另外，由于超临界CO2萃取过程主要靠流体与原料的充分接触完成萃取，因此具有杂质少，无污染，后期处理方便等优点，同时，通过简单比较可知，其操作过程较传统有机提取方法简单的多，因此，超临界CO2萃取技术可以作为替代传统有机萃取方法应用于杜仲叶总黄酮的工艺提取中。

[1]程光丽.杜仲有效成分分析及药理学研究进展[J].中成药，2006（5）：723-725.

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[3]李建民.杜仲抗氧化生物活性研究进展[J].中医药学报，2010,3（8）：138.

[4]孟良玉，兰桃芳，卢佳琨，等.败酱草中黄酮类化合物提取及其抗氧化活性[J].食品科学，2010,31（24）：214-217.

[5]周程艳,马红翠,王美,等.不同采收期杜仲叶和果实总黄酮和多糖含量比较[J].中国实验方剂学杂志,2011,17 (11):111-114.

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[11]李作美，王永斌，高世霞，等.超临界CO2萃取竹叶中总黄酮的研究[J].中国酿造，2009（6）：102-104.

[12]刘俊海，任慧兰，裘爱泳，等.杜仲叶总黄酮提取工艺研究[J].食品与机械，2007,23(4):92-95.

（责任编辑 卞建宁）

Extraction of total Flavonoids from Eucommia Ulmoid leaves by Supercritical Fluids CO2

WANG Hua-fang
(College of Food Garden,Sanmenxia Polytechnic，Sanmenxia 472000,China)

Studied the extraction technological conditions of the supercritical fluids CO2in Eucommia ulmoide leaves.Then with the the extraction rate of total flavonoids as the index,through the design of L9(33)orthogonal test to research the effects of three factors for the extraction rate.The result showed that the effect order is the press highest,then is temperature,and the time is lowest.And the optimum extraction conditions as follows the press 30MPa,the temperature 50℃and the time 120min.In the optimum extraction conditions,the extraction rate is 10.55%.

Supercritical CO2;Extraction;Leaves of eucommia ulmoides;Total flavonoids

TS201.1

A

1671-9123（2015）02-0132-05

2015-01-29

王华芳（1982-），女，河北邯郸人，三门峡职业技术学院食品园林学院讲师。