7种酚类化学物质对活性污泥的呼吸抑制作用

古文，周林军，刘济宁，石利利,*，陈国松

1. 环境保护部南京环境科学研究所，南京 210042 2. 南京工业大学 理学院，南京 210009

7种酚类化学物质对活性污泥的呼吸抑制作用

古文1,2，周林军1，刘济宁1，石利利1,*，陈国松2

1. 环境保护部南京环境科学研究所，南京 210042 2. 南京工业大学 理学院，南京 210009

苯酚类化学物质是废水中常见的有机污染物，其对活性污泥的毒性数据对于污水处理厂稳定运行和化学品危害性评估具有重要意义。本研究采用活性污泥呼吸抑制试验(209)测定7种酚类化学物质对活性污泥的呼吸抑制作用。结果显示，2,6-二叔丁基苯酚和对特辛基苯酚对活性污泥未产生明显的毒性效应；2,4-二氯酚、2-苯基苯酚、4-硝基酚、4-氯酚和对甲酚等5种化学物质都对活性污泥呼吸有不同程度的抑制效应，3 h-EC50值分别为49.7、77.6、102、150.1和462 mg·L-1，构效关系分析结果表明-Cl、-NO2等官能团是导致活性污泥呼吸抑制效应增强的关键因素。在化学品生物降解性测试研究中，要确保有毒化学物质的测试浓度低于EC50值的1/10。

酚类化学物质；活性污泥；呼吸抑制；毒性

化学品的大量使用在造福人类的同时，也给人与环境带来了严重的危害。具有持久性、富集性和生物毒性的化学物质进入环境后，对自然生态系统包括微生物、无脊椎动物、脊椎动物等不同营养级物种造成不同程度的影响[1]。

有机化学品一般先随废水通过工业或生活污水处理厂的活性污泥工艺(activate sludge process, ASP)[2]进行生化处理，被活性污泥中的微生物降解和氧化，从而从污水中去除[3-4]。通常ASP能够降解大多数易降解化学物质，从而显著的降低化学物质在环境中的残留浓度。但是有些化学物质会对活性污泥产生一定的毒性效应，如芳香类化学物质的存在会降低细菌细胞对碳源的生物利用，改变细胞膜的结构，从而引起系统溶解氧的降低[5]，以及污泥膨胀和降低泥水分离的效率，最终导致有机化合物的去除率下降和污水处理厂操作异常[6]。在化学品的风险评估中，生物降解性数据是评估化学物质持久性等危害特性的重要数据。生物降解测试之前应先开展化学物质对微生物的毒性评估，生物降解试验中受试化学物质的浓度都应低于EC50的1/10，以确保其不会对接种物产生抑制效应，从而准确的评估化学物质的生物降解性。因此化学品对活性污泥的呼吸抑制毒性数据对于评估化学品的危害性具有重要意义。

为了评估化学品对活性污泥的呼吸抑制毒性效应，国内外研究人员采用了多种测定方法，如发光细菌试验[7]、硝化抑制试验[8]、呼吸抑制试验[9]、微生物生长代谢测定以及酶活抑制[10]等。然而，生物发光试验、微生物生长代谢试验、酶活测定方法耗时耗材，且操作相对繁琐，而活性污泥呼吸抑制试验方法快速、可靠，并且成本低廉，能够很好的评估化学品对活性污泥的毒性效应。

酚类化学物质广泛用于印染、农药、医药、石油化工[11-12]等行业，它们大都是芳香烃的羟基衍生物，是工业废水中常见的有机污染物，具有原生质毒，对所有生物活性体均能产生毒性，有些甚至属高毒物质，具有很强的抗降解能力和环境持久性[13]。近年来，氯代酚等多种酚类化学物质已被列入美国环保局(EPA)和中国环境保护部的优先污染物名单[14]。本文根据化学品测试方法209(活性污泥呼吸抑制试验)[15]，选择7种典型酚类化学物质测定对活性污泥的呼吸抑制毒性，并初步探讨了对活性污泥的毒性机制。该研究为化学品的风险评估，尤其是对接种物的毒性和降解性评估提供了基础数据和方法学参考。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 仪器与试剂

CR22GⅡ冷冻干燥离心机(HITACHI HIIMAC，日本)、MS105-DU电子天平(Mettle Toledo，瑞士)、曝气泵(ACO-002，上海)、溶解氧-pH测定仪(HQ-40d，美国)、恒温磁力搅拌器(国华，HJ-3)、纯水仪(Milli-Q，美国)。

受试物信息：2-苯基苯酚(CAS：90-43-7，AR，百灵威化学)；4-硝基苯酚(CAS：100-02-7，AR，百灵威化学)；2,6-二叔丁基苯酚(CAS：128-39-2，AR，百灵威化学)；对特辛基苯酚(CAS：140-66-9，AR，百灵威化学)；对甲基苯酚(CAS：1319-77-3，AR，百灵威化学)；4-氯苯酚(CAS：106-48-9，AR，百灵威化学)；2,4-二氯苯酚(CAS：120-83-2，AR，百灵威化学)；参比物：3,5-二氯苯酚(CAS：591-35-5，AR，百灵威化学)。

活性污泥采自南京某污水处理厂曝气池，活性污泥培养根据标准方法[15]。培养基组成为：蛋白胨16 g·L-1、牛肉浸膏11 g·L-1、尿素3 g·L-1、NaCl 0.7 g·L-1、CaCl2·2H2O 0.4 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.2 g·L-1、K2HPO42.8 g·L-1。预处理的活性污泥悬浮液浓度为1 500 mg·L-1，在充氧条件下连续驯化24 h。

1.2 呼吸抑制测试

试验中用1 L烧杯作为培养瓶，每只培养瓶添加一定浓度的酚类受试物，污泥悬浮液250 mL，合成污水16 mL，最后用去离子水定容至500 mL。此外，用2个不含受试物的培养瓶作为空白对照。试验采用3,5-二氯苯酚作为参比物检验污泥的活性，参比物对照组中3,5-二氯苯酚浓度分别为3 mg·L-1、10 mg·L-1和30 mg·L-1。每只培养瓶用曝气泵连续充氧曝气3 h，3 h曝气停止后迅速测量各个培养瓶内溶解氧的变化情况。

预试验中各受试物的添加浓度分别为10 mg·L-1、100 mg·L-1和1 000 mg·L-1。如果预试验结果EC50小于1 000 mg·L-1，则开展正式试验。正式试验中受试物浓度按照预试验的EC50值设置，正式试验中每个试验浓度采用2个平行对照。

1.3 数据处理

(1)呼吸速率计算

活性污泥耗氧速率R按下列公式计算：

(1)

式中：R为活性污泥耗氧速率(mg O2·(L·h)-1)；Q1为氧气吸收的上限值mg·L-1；Q2为氧气吸收的下限值mg·L-1；Δt为2次测量的时间间隔(s)。

(2)抑制率计算

(2)

式中：I为抑制率，FA为受试物的呼吸速率，FB为空白对照的平均呼吸速率。

利用Origin8软件以及Logistic方程推算受试物EC50。

2 结果与讨论(Results and discussion)

2.1 活性污泥活性检验

采用3,5-二氯苯酚作为参比物，检验活性污泥的活性及试验条件的可靠性。图1(a)为3,5-二氯苯酚的呼吸速率曲线，结果表明在15 min内随着参比物浓度的增加，呼吸速率曲线变缓，呼吸速率下降。图1(b)为3,5-二氯苯酚的剂量-效应曲线，3,5-二氯苯酚的EC50为16.0 mg·L-1，该值同Polo等

[16]测定的3,5-二氯苯酚EC50=14.2 mg·L-1相吻合。同时该值处于有效性标准2～25 mg·L-1[15]之间，表明活性污泥性能良好，可用于呼吸抑制毒性的测定。

2.2 酚类受试物对活性污泥的呼吸抑制影响

2.2.1 预试验结果

预试验中酚类受试物浓度分别为10、100、1 000 mg·L-1，7种物质对活性污泥的呼吸速率的结果见图2。当浓度在10～1 000 mg·L-1的范围内时，2,6-二叔丁基苯酚和对特辛基苯酚对污泥的呼吸并未产生明显的抑制( 3 h-EC50>1 000 mg·L-1)。4-硝基苯酚、2-苯基苯酚、对甲酚、4-氯苯酚和2,4-二氯苯酚这5种物质随着浓度的增高，污泥呼吸速率明显下降，表明该5种物质对活性污泥具有不同程度的毒性。2,6-二叔丁基苯酚和对特辛基苯酚是白色片状且难溶于水的固体，生物利用度很低，毒性效应也较低。2,6-二叔丁基苯酚是一种重要的酚类抗氧化剂，侯春生[17]发现蜂王浆中的2,6-二叔丁基苯酚能够强烈的清除超氧自由基与对羟自由基，具有较低毒性，且对生物体具有抗衰老等特点，与本文研究结果一致。

2.2.2 正式试验结果

对预试验结果显示有抑制效应的5种物质开展正式试验，图3显示活性污泥暴露于不同浓度的酚类化学物质时溶解氧随时间的变化情况。结果显示，空白对照的溶解氧随时间推移很快下降到最低值。由于采集的污泥为好氧活性污泥，微生物在其生存过程中要消耗大量氧气，因此曝气停止后，空白对照的溶解氧随时间推移呈现有规律的下降。然而在添加酚类化学物质后，溶解氧随时间下降的速率相比于空白对照变慢，并且随着浓度升高呼吸速率更加缓慢，表明添加酚类化学品后，活性污泥内源呼吸逐步受到抑制，活性污泥呼吸速率逐渐减小，从而试验体系中溶解氧消耗速率降低。当4-硝基苯酚的浓度达到800 mg·L-1时，溶解氧浓度在200 s之内几乎停止下降，始终维持在9 mg O2·L-1，表明活性污泥的呼吸几乎完全被抑制。Ho等[18]使用变性梯度凝胶电泳(DGGE)观察到微生物多样性随着甲酚浓度增高而减少，并且通过测定酶活发现甲酚浓度超过100 mg·L-1以后，酶活性开始下降，从而导致甲酚降解性下降以及细胞增长速率的下降。

图1 3,5-二氯苯酚溶解氧-时间变化曲线(a)和呼吸抑制率-浓度变化曲线(b)Fig. 1 (a) Curve of dissolved oxygen against the time for 3,5-di-chlorophenol; (b) Curve of respiration inhibition rate against the concentration of 3, 5-di-chlorophenol

图2 预试验中酚类化学物质浓度与活性污泥呼吸速率变化曲线Fig. 2 Curve of activated sludge respiration rate against the concentration of each phenolic chemicals during preliminary test

图3 正式试验中各酚类化学物质的溶解氧-时间变化曲线Fig. 3 The curves of dissolved oxygen against time for several phenolic chemicals during definitive test

酚类化学物质的呼吸抑制率随浓度变化曲线见图4，从图中可见，5种酚类物质对活性污泥的呼吸抑制效应随着浓度的增加而增加。表1为7种酚类受试物分别在预试验和正式试验中获得的EC50数据，结合图4可知各酚类物质的毒性从大到小顺序依次为2, 4-二氯酚、2-苯基苯酚、4-硝基苯酚、4-氯酚和对甲酚，EC50分别为49.7、77.6、102、150.1和462 mg·L-1。

2.2.3 氯原子对毒性效应的影响

2,4-二氯酚对活性污泥的抑制效应( EC50=49.7 mg·L-1)明显高于4-氯酚( EC50=150 mg·L-1)，可能是因为2,4-二氯酚容易比4-氯酚吸附于污泥，且更易于进入细胞膜。研究表明，活性污泥中的微生物细胞主要靠含大量水分的胞外聚合物质(EPS)保护从而不受外界有毒物侵害[9,19]，而EPS内亲疏水基团的比例成为有机污染物吸附能力的关键[20-21]。对于酚类化学物质来说，通过电离以及未电离的形式扩散进入细胞膜速率的不同导致它们各自不同的毒性[22]。4-氯酚和2,4-二氯酚都是难溶

于水的化合物，具有一定的脂溶性，氯原子数量的不同导致其各自疏水性能的大小，最终影响着各自在细胞膜上的吸附、积累、界面传输以及与酶蛋白结合等过程，有机物脂溶性越强越易穿过细胞膜被吸附[23]，从而干预细胞内蛋白质，核酸以及部分酶的正常代谢，对活性污泥微生物产生较高的毒性。Chen等[3]研究发现2,4-二氯酚在1～20 mg·L-1时活性污泥的氧呼吸速率开始有了轻微减小，同时在添加较高浓度的2,4-二氯酚时，由于促使污泥产生较多的EPS，从而活性污泥的理化性质以及絮凝能力都受到影响。

2.2.4 暴露时间对毒性效应的影响

4-氯酚以及2, 4-二氯酚具有一定的挥发性，为了避免试验过程中随着时间延长而挥发损失，正式试验中将暴露周期由原来的3 h调整为0.5 h，同时为了增加受试物同污泥的有效接触，试验前各个物质进行了加热搅拌使其最大程度的溶解。从表1中可以发现2种物质正式试验的EC50同预试验结果都存在差异，表明暴露时间以及温度的改变对物质的毒性有着直接的影响。

图4 酚类化学物质的抑制率随浓度变化曲线Fig. 4 The curve of respiration inhibition rate against the concentration of phenolic chemicals

表1 5种酚类化学物质的预试验和正式试验3 h-EC50和95%置信限Table 1 EC50 value and 95% confidence limit for phenolic chemicals during preliminary test and definitive test

2.2.5 呼吸抑制法与发光细菌法对EC50的影响

Polo等[12]使用OECD方法得出的4-氯酚在好氧条件下EC50是97 mg·L-1，使用发光细菌试验的结果为1.9 mg·L-1。提出了氯酚类物质的毒性受到取代氯原子的位置和数量的影响这一规律。据报道当氯占据邻位基团时，氯酚类物质的毒性会减小[24-25]。李娟英等[10]研究了2, 4-二氯酚对海水发光菌以及脱氢酶活性的抑制，结果表明2, 4-二氯酚对发光细菌EC50为4.95 mg·L-1，对脱氢酶活性的EC50为37 mg·L-1。分析可知，发光细菌试验EC50与本文试验结果相比偏小，可能是因为化学物质对单一菌群的抑制效应较混合菌群( 活性污泥)的抑制效应更为明显。因此为了更准确、科学地判定污水处理厂中有机污染物的毒性，应当将发光细菌这一类生物同活性污泥联立起来开展化学品毒性测试。

2.2.6 官能团对毒性效应的影响

本研究中7种苯酚类化学物质所含的官能团分别有-NO2、-Cl、-CH3、苯基、对特辛基、叔丁基和羟基。从研究结果可以看出，对特辛基、叔丁基和羟基几乎不会对活性污泥存在抑制效应。4-硝基苯酚毒性效应( EC50=102 mg·L-1)稍大于4-氯酚( EC50=150 mg·L-1)，2种物质的分子结构差异仅在于-NO2和-Cl的差异，说明-NO2对微生物的毒性要高于-Cl。

微生物体内含有大量的酶，这些酶通常通过亲电效应来与化学品发生结合或反应。当化学品分子上连接了-Cl、-Br、-NO2等取代基后，由于这些基团较强的吸电子效应，将会显著降低酶的性状和功能。常见的官能团中，按照吸电子能力强弱排序为：-SO3>-NO2>-Br>-Cl>-H>-NH2>-OCH3>-CH3>-COOH>-OH。因此，4-硝基苯酚、氯酚类化学品因含-NO2以及-Cl官能团，使得它们对微生物的毒性显著增强，且毒性随着取代基氯原子增加而变大。由于苯环上氯原子增多，导致正电性增强，因此氯代芳烃类化合物毒性一般较大[26]。此外，这些毒性基团的位置也对毒性效应有明显的差别，毛明现和余训民[27]认为氯离羟基越远或者多个氯在羟基邻位的同一侧，则毒性越大。由于引入氯原子后化学物质的毒性明显加大，故氯原子是影响芳烃化合物毒性的主要基团。

综上，本研究采用209方法，评估7种酚类化学物质对活性污泥微生物的呼吸抑制效应。结果显示5种酚类物质对微生物呼吸产生明显的抑制。其毒性大小依次为2,4-二氯酚、2-苯基苯酚、4-硝基酚、4-氯酚和对甲酚，相应的EC50值分别为49.7、77.6、102、150.1和462 mg·L-1。研究表明化学物质对微生物的毒性会受到其结构、溶解度、官能团的亲疏水性等因素影响。此外，本文中获得的微生物毒性数据以及相关结论可以为化学品风险评估，特别是酚类化学品的生物降解性研究以及微生物毒性评价提供有效的建议和参考。

致谢：感谢环保部南京环境科学研究所石利利和刘济宁老师在文章修改中给予的帮助。

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◆

Respiratory Inhibition Effect of Seven Phenolic Chemicals on Activated Sludge

Gu Wen1,2, Zhou Linjun1, Liu Jining1, Shi Lili1,*, Chen Guosong2

1. Nanjing Institute of Environmental Sciences, Ministry of Environmental Protection, Nanjing 210042, China 2. College of Science, Nanjing Tech University, Nanjing 210009, China

17 November 2014 accepted 7 January 2015

Phenolic chemicals are ubiquitous organic contaminants in wastewater. The toxicity data of those compounds on activated sludge is of vital importance to steady operating of sewage treatment plant and performing of chemicals hazard assessment. In this study, respiratory inhibition effect of seven phenolic chemicals on activated sludge was tested by employing the activated sludge respiration inhibition test (TG 209). The experimental results indicated that there is no significant respiratory inhibition effect on activated sludge for 2,6-di-tert-butylphenol and 4-(1,1,3, 3-tetramethy(butyl)-phenol. However, significant respiratory inhibition effect on activated sludge was observed for other five tested phenolic chemicals i.e. 2,4-dichlorophenol, 2-phenyl-phenol, 4-nitrophenol, 4-chlorophenol and p-cresol. And their 3 h-EC50values were 49.7, 77.6, 102, 150.1 and 462 mg·L-1, respectively. The structure-activity relationship analysis results indicated that the functional groups such as -Cl, -NO2are key factors for strong inhibiting of activated sludge respiration. In addition, the results present here also imply that the tested concentration of those toxic compounds should be lower than 1/10 EC50in their biodegradability test.

phenolic chemicals; activated sludge; respiratory inhibition; toxicity

国家高技术研究发展计划(863计划)(No.2013AA060A308)；环保公益性行业科研专项经费(No. 2013467028)；中央级公益性科研院所基本科研业务专项(化学品污水处理厂暴露预测模型构建)

古文(1989-)，男，硕士，研究方向为化学品生态毒理评价，E-mail: guwen_1224@163.com；

*通讯作者(Corresponding author)， E-mail: sll@nies.org

10.7524/AJE.1673-5897.20141117002

2014-11-17 录用日期：2015-01-07

1673-5897(2015)2-276-07

X171.5

A

石利利(1966-)，女，硕士，研究员，主要从事化学品风险评估研究工作。

古文, 周林军, 刘济宁, 等. 7种酚类化学物质对活性污泥的呼吸抑制作用[J]. 生态毒理学报, 2015, 10(2): 276-282

Gu W, Zhou L J, Liu J N, et al. Respiratory inhibition effect of seven phenolic chemicals on activated sludge [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(2): 276-282(in Chinese)