双酚A对纳米二氧化钛理化特性及其DNA损伤效应的影响

刘燕婕，张艳红，吕斌,*

1. 长江航运总医院/武汉脑科医院检验科，武汉430015 2. 华中科技大学公共卫生学院，武汉 430030

双酚A对纳米二氧化钛理化特性及其DNA损伤效应的影响

刘燕婕1,2，张艳红2，吕斌2,*

1. 长江航运总医院/武汉脑科医院检验科，武汉430015 2. 华中科技大学公共卫生学院，武汉 430030

纳米二氧化钛(nano-TiO2)应用领域广泛，由于其对有机物或生物分子有吸附作用，二者相互反应，对各种细胞可能产生与nano-TiO2单独作用时不同的毒性作用。为探讨双酚A(BPA)对nano-TiO2理化性质的影响，以及BPA和nano-TiO2联合暴露对人胚肝L-02细胞的DNA损伤效应。用不同缓冲液，测定不同浓度的BPA(0、0.1、1、10 mol·L-1)对不同浓度nano-TiO2(0、0.1、1、10 mg·L-1)的粒径、表面电位和吸附能力的影响；然后测定不同浓度BPA和nano-TiO2联合暴露对人胚肝L-02细胞DNA双链断裂、DNA损伤关键修复酶hMsh2基因(hMsh2)、O6-甲基鸟嘌呤甲基转移酶(MGMT)和DNA依赖蛋白激酶复合物催化亚基(DNA-PKcs)的mRNA表达水平表达的影响。结果表明在不同缓冲液中，随着BPA浓度的增加，nano-TiO2粒径增加，表面电位上升，在细胞培养液DMEM中这一变化趋势最为明显；但在不同缓冲液中nano-TiO2对BPA的吸附能力无明显差异。单独nano-TiO2暴露不引起DNA双链断裂，对DNA损伤修复关键酶的表达也无明显影响，但nano-TiO2可加重BPA的DNA双链断裂效应。与相应剂量的BPA单独染毒组比较，nano-TiO2与BPA混合染毒组的细胞DNA双链断裂损伤加重(P<0.05)，hMsh2、MGMT和DNA-PKcs的基因表达水平明显上升(P<0.05)。上述研究结果显示BPA可促进nano-TiO2团聚，但团聚的nano-TiO2仍可吸附BPA。单独nano-TiO2暴露无DNA损伤作用，但nano-TiO2可加重BPA的DNA双链断裂效应。其中hMSH2、MGMT和DNA-PKcs都参与2种污染物联合暴露所致的DNA损伤修复。

纳米二氧化钛；双酚A；理化性质；联合暴露；DNA损伤

纳米二氧化钛(nano-TiO2)是最常使用的纳米材料之一，广泛应用于牙膏、防晒霜、化妆品、食品、药物中[1]。nano-TiO2由于具有粒径小、比表面积大、表面原子暴露等特点，可穿透细胞膜进入细胞内，产生大量活性氧(ROS)，对细胞造成不同程度的氧化应激损伤，包括DNA损伤和染色体断裂等[2-4]。近年来随着纳nano-TiO2的应用日渐增多，大量进入环境中的nano-TiO2很容易吸附环境中的不同污染物，可能产生与nano-TiO2单独作用时不同的毒性作用[5]。

双酚A(BPA)广泛用于塑料瓶、食品和饮料容器制备及罐头内侧涂层等[6]。BPA具有雌激素效应，属于环境雌激素，不但会干扰体内雌激素平衡，还可通过氧化应激导致机体损伤[7]。由于BPA在环境中广泛存在，极易与nano-TiO2产生联合作用，影响两者的理化特性，并进一步影响其联合毒性效应。

纳米颗粒物与有机物的相互作用可影响纳米颗粒的物理化学特性和吸附性能，并进一步影响联合暴露的毒性效应[8]。BPA和nano-TiO2均可导致DNA损伤，DNA损伤也是肿瘤等多种慢性毒性效应的主要早期生理和病理改变之一。为此，本研究以人胚肝L-02细胞的DNA损伤作为毒性评价指标，首先研究了BPA对nano-TiO2理化性质的影响，然后分析BPA和nano-TiO2联合暴露对人胚肝L-02细胞DNA断裂和修复的影响，为深入了解纳米材料的生态效应提供实验依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 主要试剂和细胞株

纳米粒度分析仪Delsa NanoC，购自美国Beckman公司；Waters Micromass-quattro Micro三重四级杆串联质谱仪(HPLC-MS/MS)，购自美国Waters公司；Nano-TiO2(Degussa P25型，锐钛矿型/金红石型=8/2)，购自德国Degussa公司；BPA为化学纯，购自美国Sigma公司；细胞培养液DMEM，购自美国Sigma-aldrich公司；人胚肝细胞L-02，购于武汉大学典型培养物收藏中心，本实验室保存。胎牛血清，购自美国Gibco公司；Trizol试剂，购自美国invitroge公司；M-MLV逆转录试剂，购自Promega公司；PCR引物由上海博亚生物技术公司合成。

1.2 实验方法

1.2.1 粒径和Zeta电位检测

在纯水、CaCl2和DEME培养基中，分别配制nano-TiO2(1、5、10 mg·L-1)和BPA (0、0.1、1、10 μmol·L-1)的混合溶液，然后用纳米粒度分析仪在不同时间内(0～60 min内)测定粒径和Zeta电位。

1.2.2 nano-TiO2对BPA的吸附实验

在纯水、CaCl2和DEME培养基中，分别配制含10 mg·L-1nano-TiO2和10 μmol·L-1BPA的混合溶液，混合后不同时间段内分别取1 mL混合溶液，12 000 r·min-1离心5 min后取上清液，0.22 μm滤膜过滤后用HPLC-MS/MS检测。以未加入nano-TiO2(10 mg·L-1)的不同浓度BPA作对照组检测。为防止BPA光降解nano-TiO2，整个实验需避光检测。

1.2.3 细胞培养及处理

L-02细胞于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，5%CO2、37 ℃常规培养，取对数生长期细胞进行染毒，分组见表1，阴性对照组只加培养基，以300 μmol·L-1H2O2为阳性对照组。各组在无血清的培养液中继续培养24 h。

1.2.4 中性彗星实验

首先将1%正常熔点琼脂糖100 μL铺于磨砂载玻片上，室温下固化1.5 h后，加上混有1.0×105个细胞的0.50%低熔点琼脂糖100 μL，盖上盖玻片4 ℃条件下放置10 min，去掉盖玻片后在避光的条件下，在裂解液(2.5 mol·L-1NaCl、100 mmol·L-1Na2EDTA、10 mmol·L-1Tris base、1% Triton-X 100 and 10% DMSO)裂解1 h后，置于新鲜冰冷电泳缓冲液(0.3 mol·L-1CH3COONa，pH=8.5)中电泳40 min(电压25 V，电流300 mA)。停止电泳后，10 μg·mL-1的溴化乙啶染色拍照。用CASP软件分析细胞，以Oliver尾矩(Olive Tail Moment，OTM，即尾部DNA百分含量×(尾光密度中心-头光密度中心)为评价指标，每个样本随机分析100个细胞)。

1.2.5 RT-PCR实验

Trizol提取细胞总RNA，采用M-MLV逆转录试剂扩增目的基因。扩增产物于2%琼脂糖凝胶中电泳(含0.5 μg·mL-1的溴化乙锭)，并分析光密度，PCR产物量以积分光密度×面积表示。以GAPDH为对照，目的条带与对照组的灰度值的比值表示mRNA的表达水平。

1.3 统计学方法

2 结果(Results)

2.1 BPA对nano-TiO2理化特性的影响

2.1.1 BPA对nano-TiO2粒径和Zeta电位的影响

在pH=7.7时，nano-TiO2表面带负电荷，加入BPA后，nano-TiO2粒径增加，表面Zeta电位升高，其中nano-TiO2在含Ca2+(0.2 g·L-1CaCl2)的DMEM培养基中的粒径最大(表1)。此外，在任意介质中，随着时间和BPA浓度的增加，nano-TiO2的粒径增大，Zeta电位上升(图1)。显示BPA能促进nano-TiO2团聚，具剂量-效应关系。

表1 在不同缓冲液中BPA对nano-TiO2粒径和Zeta电位的影响(n=3)Table 1 Average particle size and zeta potential of nano-TiO2 and BPA mixture in different solutions (n=3)

注： *与纯水组比较，P<0.05；a所用数据为动态光散射3次平均值。

Note: * compared with pure water, P<0.05；a, Data were the average value of three measurements by the dynamic light scattering.

图1 不同介质中nano-TiO2对BPA的吸附动力学曲线Fig. 1 Adsorption kinetics of BPA by nano-TiO2 in different media

2.1.2 BPA对nano-TiO2吸附特性的影响

在任意pH=7.7的介质中，10 mg·L-1nano-TiO2与10 μmol·L-1BPA混合时，nano-TiO2可有效吸附BPA，在300 min左右达到吸附平衡，平衡时BPA吸附率为22%左右。nano-TiO2吸附BPA的量在各个

介质中无显著差异(图1)。

2.2 nano-TiO2和BPA联合暴露对DNA的损伤效应

中性彗星试验显示的是DNA双链断裂效应，结果显示本实验nano-TiO2剂量下单独作用不引起明显L-02细胞DNA断裂损伤(P>0.05)；而10 μmol·L-1BPA单独作用可显著性增加L-02细胞DNA双链断裂(P<0.001)；BPA与nano-TiO2联合染毒可显著增加L-02细胞DNA断裂损伤，并且随着BPA浓度的升高，Olive尾矩增加，呈现剂量-效应关系。二因子析因分析，二者混合染毒有显著效应，存在协同作用(F=213.93，P<0.001)(表2)。

2.3 nano-TiO2和BPA联合暴露对DNA损伤修复关键酶mRNA表达的影响

RT-PCR实验表明DNA损伤修复关键酶mRNA的表达水平。结果表明高浓度(10 μmol·L-1)的BPA与nano-TiO2共同作用于L-02细胞时，均可明显升高MGMT、hMsh2和DNA-PKcs的RNA表达量，低浓度BPA与nano-TiO2的相互作用对各个酶活性无明显的影响(P<0.05)。见表3。

表2 BPA与nano-TiO2联合暴露对DNA断裂损伤效应Table 2 Combined effect of BPA and nano-TiO2 exposure on DNA damage (Oliver tail ±s))

注：*与阴性对照组(0.31±0.47)比较，P<0.05。

Note: *compared with negative control group (0.31±0.47), P<0.05.

表3 BPA与nano-TiO2联合暴露对DNA损伤修复关键酶mRNA表达的影响Table 3 Combined effect of BPA and nano-TiO2 exposure on the expression level of DNA damage repair enzymes

注：*与hMSH2阴性对照组(1.63±0.13)比较，P<0.05；#与DNA-PKcs阴性对照组(1.69±0.53)比较，P<0.05；※与MGMT阴性对照组(1.82±0.42)比较，P<0.05。

Note: * compared with hMSH2 negative control group (1.63±0.13), P<0.05;#compared with DNA-PKcs negative control group (1.69±0.53), P<0.05;※compared with MGMT negative control group (1.82±0.42), P<0.05.

3 讨论(Discussion)

纳米材料在自然环境下易于聚集，从而影响纳米颗粒的分布和毒性。P25 nano-TiO2的初始平均粒径为25～50 nm，表面带负电荷。由于同种电荷之间互相排斥，nano-TiO2的表面电荷可在一定程度上使其保持分散性。当nano-TiO2溶解在水溶液中，-OH等溶解在水中的离子或分子会结合于nano-TiO2表面，改变nano-TiO2的表面电荷从而使颗粒有一定的团聚。BPA的解离常数为9.7，因此在pH =7.7时,未解离的BPA可与覆盖于nano-TiO2表面的-OH产生竞争，减少nano-TiO2表面的-OH，Zeta电位上升，nano-TiO2团聚程度增加，并呈现一定的时间和剂量关系。溶液中的离子浓度明显影响nano-TiO2的Zeta电位和团聚程度。nano-TiO2和BPA在CaCl2和含大量离子的DMEM溶液中的Zeta电位和团聚程度明显高于纯水，说明溶液中的离子是影响团聚的主要因素。

虽然nano-TiO2在不同介质中的Zeta电位和团聚程度不同，但并不影响其对BPA的吸附能力，说明团聚状态并非影响纳米材料吸附性能的主要因素。团聚状态的nano-TiO2仍可以有效吸附BPA，因此纳米材料在环境中的潜在毒性效应值得高度重视。

单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis, SCGE)，又称彗星实验(comet assay)，能够灵敏地检测DNA断裂。其中中性彗星试验能测定DNA双链断裂等。本实验结果显示，高浓度BPA(10 μmol·L-1)单独染毒可导致DNA双链断裂。 nano-TiO2单独染毒在本实验剂量下没有明显的DNA双链损伤效应，但联合染毒时可促进BPA的双链断裂损伤效应(P<0.001)，两者具有协同效应。协同作用使混合暴露组在低浓度即发生了明显的DNA断裂损伤(表2)，显示低浓度BPA和nano-TiO2联合暴露时潜在的生态和健康风险增加。以往有研究表明纳米颗粒可穿透细胞膜，进入到细胞内线粒体膜，干扰线粒体功能产生ROS[9]。ROS作为第二信使参与信号转导，启动多种细胞生物学效应。但当各种外源或内源性因素引起的ROS超过体内的清除能力时，则会导致细胞内的一些生物大分子(脂质、蛋白质、DNA等)受到损伤。现认为在氧化应激条件下，细胞ROS水平升高，超过机体清除能力，可以攻击DNA分子中的单个碱基和核糖部分，造成DNA链断裂增加[10]。Matsuoka等[11]发现20 mg·mL-1的nano-TiO2与支气管上皮细胞作用，引起的氧化应激反应，ROS的产生超过细胞抗氧化系统的清除能力。近期研究还表明nano-TiO2和一氧化碳联合暴露能加速ROS生成，最终导致脂质过氧化反应和DNA损伤[12]。综合以上文献，本实验nano-TiO2与BPA联合染毒时，对DNA损伤的协同效应，很可能与ROS水平升高有关，但具体机制有待进一步阐释。

DNA损伤修复酶在修复DNA断裂与维护细胞稳定方面具有重要作用。MGMT是参与烷基化损伤的关键酶[7]；hMsh2是一种重要的DNA错配修复基因，其产物参与错配修复途径中识别DNA错配并启动修复反应的作用[13]；DNA-PKcs与ku蛋白结合形成DNA依赖的蛋白激酶全酶(DNA-PK),在双链DNA断裂的非同源末端结合修复途径中发挥重要作用，同时DNA-PKcs还可以通过磷酸化Sp1、fos、P53等一系列蛋白质底物广泛参与转录、信号传导及凋亡等细胞过程[14]。本研究显示，nano-TiO2单独作用，并不引起DNA断裂，也不影响DNA断裂相关酶的RNA表达水平，但nano-TiO2与不同浓度的BPA联合染毒，与相应剂量的BPA单独染毒比较，各种DNA修复酶表达水平均升高，说明nano-TiO2可增加BPA的DNA损伤及随后发生的DNA损伤修复水平。烷基化修复、错配修复和DNA断链修复等修复途径均可能参与nano-TiO2与BPA联合暴露所致DNA损伤的修复。

综上所述，nano-TiO2在环境和生物介质中易于团聚，但团聚的nano-TiO2仍可有效吸附痕量BPA，并增加BPA的DNA损伤效应。两者的DNA损伤作用具有协同效应，同时增加DNA修复酶的表。因此在考虑纳米材料的毒性效应时，需要进一步评价团聚的纳米材料的潜在毒性效应。

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Impacts of Bisphenol A on Physicochemical Properties and DNA Damage Effects of Titanium Dioxide Nanoparticles on Human Embryo Liver Cell

Liu Yanjie1,2, Zhang Yanhong2, Lu Bin2,*

1. Laboratory Department, General Hospital of Yangtze River Shipping/Wuhan Brain Hospital, Wuhan 430015, China 2. School of Public Health, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China

2 November 2014 accepted 4 February 2015

Titanium dioxide nanoparticles (nano-TiO2) have been used widely and may react with a wide range of organic and biological molecules and then exhibit toxic effects in various cell lines, with or without photo activation. The effects of the interaction of TiO2nanoparticles (nano-TiO2) with bisphenol A (BPA) on their physicochemical properties and DNA damage effects in human embryo L-02 hepatocytes were evaluated. Different concentrations of BPA (0, 0.1, 1, 10 μmol·L-1) and nano-TiO2(0, 0.1, 1, 10 mg·L-1) were mixed to analyze the size distribution, zeta potential and adsorption capacity of nano-TiO2in different media. Then L-02 cells were exposed to different concentration of BPA (0, 0.1, 1, 10 μmol·L-1) and nano-TiO2(0, 0.1, 1, 10 mg·L-1) for 24 hours, respectively. DNA damage and the expression of DNA repair enzymes O6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT), DNA-dependent protein kinase catalytic subunit (DNA-PKcs) and hMSH2 in L-02 cells were analyzed. Results indicated that addition of BPA to nano-TiO2dispersions increased the aggregation level and zeta potential of nano-TiO2in all media. Nano-TiO2had a similar adsorption capacity in different media, although a higher aggregation level was observed in cell culture medium. Obviously, Interactions of nano-TiO2with BPA increased agglomeration and zeta potential, but did not influence the adsorption capacity of nano-TiO2. The aggregated nano-TiO2can enrich BPA effectively. Toxicity analysis showed that nano-TiO2did not induce significant DNA damage, but the mixture of nano-TiO2and BPA increased DNA double strand breaks and the expression of three DNA repair enzymes. It is clear that BPA and nano-TiO2mixture induce synergistic DNA damage effects. And hMSH2, MGMT and DNA-PKcs all participated in the DNA damage repair pathway induced by the mixture of BPA and nano-TiO2.

titanium dioxide nanoparticles; bisphenol A; physicochemical characters; combined exposure; DNA damage

国家863项目(No. 2012AA06A304)；国家自然科学基金项目(No. 21277054)；交通运输部长江航务管理局科技项目(No. 201410015)

刘燕婕(1967-)，女，博士，研究方向为环境毒理学，E-mail: liuyanjie0411@aliyun.com；

*通讯作者(Corresponding author)， E-mail: lubin@mails.tjmu.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20141102003

2014-11-02 录用日期：2015-02-04

1673-5897(2015)2-224-06

X171.5

A

吕斌(1967-)，女，博士，教授，主要研究方向为环境毒理学，发表论文80余篇。

刘燕婕, 张艳红, 吕斌. 双酚A对纳米二氧化钛理化特性及其DNA损伤效应的影响[J]. 生态毒理学报, 2015, 10(2): 224-229

Liu Y J, Zhang Y H, Lu B. Impacts of bisphenol A on physicochemical properties and DNA damage effects of titanium dioxide nanoparticles on human embryo liver cell [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(2): 224-229(in Chinese)