苯并噻唑类污染物对青海弧菌Q67毒性效应

李晓，李娜，饶凯锋，马梅，王子健

中国科学院生态环境研究中心 中国科学院饮用水科学与技术重点实验室，北京 100085

苯并噻唑类污染物对青海弧菌Q67毒性效应

李晓，李娜，饶凯锋，马梅*，王子健

中国科学院生态环境研究中心 中国科学院饮用水科学与技术重点实验室，北京 100085

以青海弧菌Q67为指示生物，结合96微孔板高通量检测技术，测定了10种环境中常见苯并噻唑类污染物对发光菌的毒性效应。结果表明，10种苯并噻唑化合物均对发光菌具有毒性效应，其EC50在1.17×10-6～5.43×10-3mol·L-1之间。对其进行毒性效应排序，发现巯基取代>氨基>2羟苯基>羧酸乙酯>溴>氟>甲基>氯>甲硫基>苯并噻唑。利用结构化学描述符和偏最小二乘法，构建了苯并噻唑类化合物对Q67发光菌毒性的定量构效关系模型(QSAR)，结果发现，氢键供体数量(ND)和极性溶剂可及分子表面积(PSASA)对其毒性具有重要意义。本研究为苯并噻唑类污染物毒性效应评价及其环境风险评价提供了参考。

苯并噻唑；青海弧菌Q67；急性毒性；QSAR

苯并噻唑(BT)类化合物是一类近年来高产量化合物，广泛应用于工业生产和日常生活中的各个领域。如被用作轮胎和橡胶的添加剂[1-2]，皮革和造纸业的杀菌剂[3]，金属行业的防腐剂[4]，和医药行业抗肿瘤剂[5]等，也可成为化工行业的中间体[2-3,6]。大多BT类化合物易溶于水，这类化合物由于被大量生产和使用，导致其在环境中广泛存在，并在工业、生活和市政污水中均有检出[7-10]。目前仅有少量研究报道了BT类物质的毒性，例如BT，2-氨基苯并噻唑(ABT)，2-甲硫基苯并噻唑(MTBT)被报道能够引起DNA损伤效应[11]；2-巯基苯并噻唑(MBT)被确定为大鼠诱变剂[12]；研究证实BT类物质能增加膀胱癌和肠道癌的风险[1,13-14]；也可对多种上皮细胞产生急性毒性[15]。目前，我国关于苯并噻唑类对于水生态环境污染的研究仍然较少，考虑到它们广泛的存在，因此对于它们毒性的筛查与评价就显得较为重要。

发光细菌毒性检测作为一种操作简单、反应快速[16]、灵敏度高的方法，已被广泛应用于环境污染物急性毒性的研究。本研究选用朱文杰等[17]分离得到的一种淡水发光菌——青海弧菌Q67(Vibrio qinghaiensis sp. -Q67)为指示生物，来检测污染物的毒性。该菌具有独特的生理特性，在淡水体系中能正常发光，不需要添加大量的氯化钠，可直接应用于淡水环境样品的生物毒性测试[18]。国内许多研究者应用该菌种建立了新型发光菌毒性测定方法，已成功用于环境污染监测[19-25]。

定量构效关系模型QSARs(quantitative structure activity relationships, QSARs)，通过建立化合物的生物活性与结构或理化参数之间的定量关系，来探求化合物的生物活性[26]。既有助于预测类似化合物的生物活性，也有助于对化合物的作用机制进行解释，已被广泛用于化合物生物活性的预测和评价[27-29]。QSARs在环境科学和毒理学领域的应用也愈加广泛[30]，为污染物的毒性预测、机制研究和风险评价提供支持。本研究选取10种常见苯并噻唑类化合物作为研究对象，结合96微孔板高通量检测技术，测定了苯并噻唑类化合物对青海弧菌Q67的半数效应浓度值EC50，采用偏最小二乘法结合结构化学分子描述符构建QSAR预测模型，并对其可能的毒性机制进行解释。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 主要仪器和试剂

仪器：高压灭菌锅(Sanyo公司)、恒温振荡摇床(HZQ-F，哈东联)、百级超净工作台(DL-CJ-1F，哈东联)、Infinite M200酶标仪(TECAN)、控温离心机(BECKMANJS-21，德国)、恒温平板摇床(Titramax 1000，Heidolph，德国)、旋涡混合器(MS2，广州IKAWorks)等。

试剂：10种苯并噻唑类化合物均购自百灵威公司，化合物的纯度见表1。

1.2 实验菌种

选用青海弧菌Q67(Vibrio qinghaiensis sp. Nov.)为毒性指示生物,由中国科学院生态环境研究中心提供。培养条件参照马梅等[19]的方法进行。

1.3 苯并噻唑类污染物对Q67发光菌的急性毒性测试

针对目前以上污染物进行毒性研究少见报道的实际情况，结合张辉等[24]96微孔板毒性测试方法，青海弧菌Q67为检测生物，以环境中检出率高、备受关注的10种常见苯并噻唑类化合物为研究对象，进行毒性测试。苯并噻唑类污染物对Q67发光菌的急性毒性测试参照文献[19-20,24-25]实验方法进行。将各物质配成系列浓度梯度，设空白对照，每个浓度设置3个平行，分别取对照溶液与测试液20 μL于微孔板中，再加入180 μL复活菌液，反应15 min后用酶标仪测定各孔的发光强度(RLU)。以空白对照的RLU的均值(I0)和各浓度的3个平行样的RLU的均值(I)计算样品对发光菌发光的相对抑制率X(%)，每块板重复3次以提高测定精度减少随机误差。其中，X(%)=(1-I/I0)×100%

2 结果(Results)

2.1 10种苯并噻唑类化合物对Q67发光菌的急性毒性

通过测定10种苯并噻唑类化合物对Q67发光菌的发光相对抑制率，用OriginPro 8拟合，这类物质对Q67发光菌的急性毒性均呈现明显的剂量效应关系，并且能很好的拟合(见图1)。依据拟合的剂量-效应曲线，可以得到10种苯并噻唑类化合物的EC50、EC20以及相关系数(r)，结果见表1。从表1中可以看出，苯并噻唑类化合物的EC50在1.17×10-6～5.43×10-3mol·L-1之间；从图1中可以看出，本文研究的苯并噻唑对于Q67发光菌的毒性抑制最小，其次是2-甲硫基苯并噻唑，最大是2-巯基苯并噻唑，这与Reemtsma等[3]研究的BT、MTBT和MBT对于费氏弧菌(Vibio fishcheri)的急性水生毒性结果相一致。

图1 10种苯并噻唑类化合物的剂量-效应曲线Fig. 1 Dose-response curves for 10 benzothiazole and benzothiazole derivatives

表1 10种苯并噻唑类化合物的logistic函数拟合结果Table 1 Fitting results of logistic functions for 10 benzothiazole and benzothiazole derivatives

2.2 10种类化合物对Q67发光菌毒性的QSAR研究

采用软件MarvinSketch5.8[31]，计算苯并噻唑类化合物的分子描述符。所计算的分子描述符包括具体计算的参数包括分子体积(V)、最高占有轨道能量(HOMO)、最低空轨道能量(LUMO)、偶极矩(μ)和分子平均极化率(α)、正辛醇/水分配系数(logD)、氢键受体个数(NA)、氢键供体个数(ND)、极性表面积分率、极性溶剂可及分子表面积(PSASA)、分子量(Mw)等。运用软件SIMCA-P 6.0中的PLS创建模型[32]，主成分分析结果如表2。拟合得到-lgEC50与量化参数的相关方程，最优模型如下：

-logEC50=1.76+1.25ND+0.02PSASA

ND极指氢键供体数量，PSASA指极性溶剂可及分子表面积。

图2 10种-logEC50的实测值与预测值的拟合图Fig. 2 Plot of observed against predicted -logEC50 values for 10 benzothiazole and benzothiazole derivatives

表2 变量在QSAR模型中的VIP及PLS权重Table 2 VIP and PLS weights of variable for QSAR model

注：“W*1”为权重；“VIP”为投影性指标。

Note: W*1, PLS weights; VIP, values of the variable importance in the projection.

3 讨论(Discussion)

本文对苯并噻唑类污染物的致发光菌发光抑制的研究表明，10种苯并噻唑化合物对发光菌的毒性效应的EC50在1.17×10-6～5.43×10-3mol·L-1之间。本文研究的化合物均含有相同的苯并噻唑环母体结构，仅取代基类型不同，对目标化合物进行毒性效应排序，发现巯基取代>氨基>2羟苯基>羧酸乙酯>溴>氟>甲基>氯>甲硫基>苯并噻唑。将理化意义明确的化学结构参数进定量构效关系建模研究(QSARs)，可以进一步从理论上探讨化合物的毒性机制，并定量研究化合物的结构与毒性间的关系，是进行生态风险评价的重要手段[30]。本研究利用偏最小二乘法和结构化学描述符，构建了苯并噻唑类化合物对Q67发光菌毒性的预测模型，结果发现，氢键供体个数(ND)和极性溶剂可及分子表面积(PSASA)和对其毒性具有重要意义(表2)。在表2中，ND和PSASA显示出十分接近的VIP及PLS权重，说明2种结构参数在所建的QSARs模型中具有同样重要的作用，这2种结构参数可以共同解释苯并噻唑类化合物对发光菌毒性的作用机制。本文的研究结果与苏丽敏等[22]的研究结果比较相近。

氢键供体(ND)反映化合物分子同其它基团形成氢键时所能给出的质子氢的个数，氢键结合是毒物与受体之间的主要作用方式之一[33-34]。在发光菌体内，化合物的毒性作用是通过毒物分子活性中心与发光菌中萤光素酶这一靶分子相互作用而产生的，黄素单核苷酸作为重要的辅酶[35]，容易与其它分子或基团形成氢键。许多研究证明，化合物的ND数量越多，与发光菌受体中的-OH、-NH或=O、O-等越易于形成氢键而增强化合物的毒性[25,36]。本文所研究的化合物的取代基中，氨基(-NH2)、羟基(-OH)和巯基(-SH)等基团都易与黄素单核苷酸结合形成氢键，则会阻碍或阻止黄素单核苷酸在氧化和还原形式之间的氢传递，使得该辅酶的活性受到抑制，从而使发光菌的发光受到抑制。所构建的QSAR模型也证明，随着ND数量的增加，苯并噻唑类化合物对发光菌的毒性作用增强。

极性溶剂可及分子表面积(PSASA)与分子的大小和形状有关，指极性溶剂体系下可以到达的化合物的表面积。所构建的QSAR模型证明PSASA数值越大，苯并噻唑类化合物对发光菌的毒性越高。PSASA在QSAR研究中，表示为空间分子结构描述符参数，由于10种苯并噻唑类化合物的取代基类型不同，其形状和大小产生了不同的立体效应，从而影响污染物与菌体内的靶蛋白的接触面积和接触几率。PSASA数值越大，污染物与靶位点作用的强度和概率越高，从而显示出更强的毒性效应。

综上所述，本研究所检测的10种苯并噻唑类化合物均对Q67发光菌具有毒性作用。利用偏最小二乘方法构建的QSAR模型预测能力较好、稳定性较高，能用来预测其他苯并噻唑类污染物对Q67发光菌的毒性效应。在所选择的结构变量中，氢键供体数量和极性溶剂可及分子表面积对其毒性具有重要意义。

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◆

Toxicities of Benzothiazole and Benzothiazole Derivatives (BTs) toVibrioqinghaiensissp. -Q67

Li Xiao, Li Na, Rao Kaifeng, Ma Mei*, Wang Zijian

Key Laboratory of Drinking Water Science and Technology, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China

24 November 2014 accepted 18 December 2014

The acute toxicities of benzothiazole and benzothiazole derivatives (BTs) to Vibrio qinghaiensis sp. -Q67 were tested using 96-well microplate high-throughout method. The results showed that the EC50s of BTs ranged from 1.17×10-6to 5.43×10-3mol·L-1. Among the substituent groups of BTs, mercapto> amino> 2-hydroxyphenyl> nonanoic acid-ethyl ester > bromo> fluorobenzene> methyl > chlororine > methylthio> benzothiazole. Molecular descriptors and partial least squares regression were used to establish quantitative structure-activity relationship (QSAR). The results showed that the number of hydrogen bond donor (ND) and polar solvent-accessiable surface area (PSASA) were important for the toxicities. This study provided some assistance to the toxic assessment and environmental risk assessment of BTs.

benzothiazole; luminescent bacteria; acute toxicity; QSAR

863课题(2014AA06A506)；国家自然科学基金重点课题(51290283)

李晓(1982-)，女，实验助理，研究方向为水生生态毒理学，E-mail: lixiao8204@163.com；

*通讯作者(Corresponding author)， E-mail: mamei@rcees.ac.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20141124002

2014-11-24 录用日期：2014-12-18

1673-5897(2015)2-167-06

X171.5

A

马梅(1967-)，女，博士，研究员，博士生导师，主要从事水生生态毒理学研究。

李晓, 李娜, 饶凯锋, 等. 苯并噻唑类污染物对青海弧菌Q67毒性效应[J]. 生态毒理学报, 2015, 10(2): 167-172

Li X, Li N, Rao K F, et al. Toxicities of benzothiazole and benzothiazole derivatives (BTs) to Vibrio qinghaiensis sp. -Q67 [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(2): 167-172 (in Chinese)