发酵豆粕中大豆异黄酮的提取及含量测定

张晓峥 邢蓬蕊 张显香 于 鑫 朱伟伟 杨志孝

(泰山医学院，山东泰安271016)

发酵豆粕中大豆异黄酮的提取及含量测定

张晓峥 邢蓬蕊 张显香 于 鑫 朱伟伟 杨志孝

(泰山医学院，山东泰安271016)

目的利用超声法从发酵豆粕中提取大豆异黄酮，探究出最佳提取条件，并对其含量进行测定。方法利用微生物发酵方法对豆粕进行发酵处理，通过超声及溶剂萃取提取方法提取发酵豆粕中大豆异黄酮，进而通过单因素及正交试验探究出最佳提取条件，利用紫外分光度法测定含量，并与未发酵豆粕中大豆异黄酮含量进行比较。结果发酵豆粕中大豆异黄酮含量达到3.27 mg/g，豆粕中含量为1.86 mg/g，大豆中含量为2.59 mg/g。豆粕发酵后大豆异黄酮的含量显著提高，是豆粕含量的1.76倍，大豆含量的1.26倍。结论发酵豆粕可作为提取大豆异黄酮的良好原料，提高豆粕附加值的同时可以节约有限的大豆资源。

发酵豆粕;大豆异黄酮;超声提取

我国大豆年产量约1200万吨，而国内压榨豆油所用大豆约4000万吨，每年大豆都有巨大的进口任务，由此产生了数千万吨的豆粕，这些豆粕除少部分用于发酵酱油、生产大豆浓缩蛋白或分离蛋白外，大部分被用作饲料，其中含有的微量生理活性物质如大豆异黄酮，绝大部分留在豆粕中而未被利用，造成豆粕资源的极大浪费。

大豆异黄酮是存在于大豆中的一种功能性成分，研究表明大豆异黄酮具有防癌、防骨质疏松症［1］、改善妇女更年期症状、防心血管之疾等诸多生理功能［2］，目前国内外都已开始发展大豆异黄酮保健品产业，但当前大多以大豆为原料，成本高且提取工序复杂，而豆粕虽然廉价易得，却因其大豆异黄酮的含量低而不受青睐。本研究中创新性地提出以发酵豆粕为原料，探究出高效简便的提取方法，进而采用单因素试验就发酵豆粕中大豆异黄酮的提取工艺进行优化，以期找出最佳的工艺参数，并与豆粕的大豆异黄酮含量对比，为以发酵豆粕为原料生产大豆异黄酮提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂纳豆芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌TQ.33、曲霉(山东农业大学);染料木素(Gen)标准品(sigma公司)，含量为99.99%;大豆、豆粕(购自山东泰安农贸市场);乙醚(AR.)，无水乙醇(AR.)，95%乙醇(AR.)。

1.2 仪器设备TG332A微量分析天平(上海，精度0.01 mg)、k-30高速冷冻离心机(sigma公司)、UV-2800紫外分光光度计(尤尼柯上海仪器公司)、灭手体式蒸汽消毒器(YXQ02型电热式，山东新华医疗厂)、净化工作台(YJ-875B，苏州中亚净化设备有限公司)、真空干燥箱(DZF-6210，上海精宏制造厂)、昆山超声提取器、加样器(德国产)。

2 实验方法

2.1 发酵豆粕的制备挑选优质大豆，清洗，浸泡6 h。常温下先接种纳豆芽孢杆菌，发酵，12 h后再接种凝结芽孢杆菌，接种量为10%，两菌比例为1: 1，发酵基质中豆粕与麸皮质量比为7:3，初始含水量为40%，初始pH值自然，37℃发酵48 h。干燥备用。

2.2 超声波提取大豆异黄酮的方法①发酵豆粕、豆粕分别用搅拌机打成细粉。②脱脂处理。用电子分析天平称取发酵豆粕细粉5 g，，置于锥形瓶中，按1:10的物料比加入50 ml石油醚，设定40℃、70 Hz、30 min超声波震荡脱脂，倒出提取液后，同样方法二次脱脂。将两次提取液用离心机离心(3000 r/min，3 min)，把沉淀的发酵豆粕细粉回收入锥形瓶。将锥形瓶中发酵豆粕细粉自然干燥。豆粕的脱脂方法同上。③大豆异黄酮提取条件筛选。为了探究最佳的提取条件，选取与提取效果相关的若干因素，分别做单因素试验。这些单因素分别是:超声波提取时间、提取温度、料液比、乙醇浓度。

2.2.1 不同超声波处理时间对大豆异黄酮提取率的影响称取脱脂的发酵豆粕细粉5g，在提取温度为70℃，料液比为1：10，乙醇浓度为95%，超声波为70 Hz的条件下，分别采用超声波处理时间为0.5 h、1 h、1.5 h、2 h做提取试验，每次试验都用乙醇提取3次，将3次提取液合并，置于离心机中，离心(3000 r/min，5 min)，取上清液转移到150 ml容量瓶中并用乙醇定容。然后利用紫外分光光度计进行含量测定，研究不同超声波处理时间对大豆异黄酮提取得率的影响。

2.2.2 不同提取温度对大豆异黄酮提取率的影响

称取脱脂的发酵豆粕细粉5 g，以优选的超声波处理时间，料液比为1:10，乙醇浓度为95%，70 Hz条件下，分别采用提取温度为60℃、70℃、80℃、90℃做提取试验，每次试验都用乙醇提取3次，将3次提取液合并，置于离心机中，离心(3000 r/min，5 min)，取上清液转移到150 ml容量瓶中并用乙醇定容。然后利用紫外分光光度计进行含量测定，研究不同提取温度对大豆异黄酮提取得率的影响。

2.2.3 不同料液比对大豆异黄酮提取率的影响

称取脱脂的发酵豆粕细粉5 g，以优选的超声波处理时间和优选的超声提取温度，乙醇浓度为95%，70 Hz条件下，分别采取料液比为1：5、1：10、1：15、1：20做提取试验，每次试验都用乙醇提取3次，将3次提取液合并，置于离心机中，离心(3000 r/min，5min)，取上清液转移到150 ml容量瓶中并用乙醇定容。然后利用紫外分光光度计进行含量测定，研究不同料液比对大豆异黄酮提取得率的影响。

2.2.4 不同乙醇浓度对大豆异黄酮提取得率的影响称取脱脂的发酵豆粕细粉5 g，以优选的超声波处理时间，优选的水提取温度，优选的料液比，分别采用乙醇浓度为70%、80%、95%、100%做提取试验，每次试验都用乙醇提取三次，将三次提取液合并，置于离心机中，离心(3000 r/min，5 min)，取上清液转移到150 ml容量瓶中并用乙醇定容。然后利用紫外分光光度计进行含量测定，研究不同浓度乙醇萃取对大豆异黄酮提取得率的影响。

2.2.5 大豆异黄酮提取的正交优化设计试验在单因素试验基础上，为了综合考虑多因素相互作用对大豆异黄酮提取率的影响，根据单因素试验结果采用L9(34)正交设计对大豆多糖提取率的条件进行优化，试验条件见表1。

表1 正交试验因素水平

2.3 大豆异黄酮标准曲线的建立及含量测定

2.3.1 待测样品的处理利用单试验及正交试验得到的最佳提取条件，分别提取发酵豆粕及豆粕中的大豆异黄酮。将两者提取液各定容至100 ml，各取1000μl置于两个10 ml容量瓶中，各用乙醇定容至10 ml，待测。

2.3.2 大豆异黄酮的测定条件选择利用UV-2800紫外分光分光度计，1 cm石英比色杯，以标准空白溶液调零后，利用染料木素12 μg/ml的标准溶液、发酵豆粕、豆粕、大豆样品提取液，分别在200～400 nm波长范围进行波长扫描，其最大吸收波长均为λmax=265 nm。

2.3.3 大豆异黄酮标准曲线建立称取染料木素5 mg溶解于5.0 ml无水乙醇中，得浓度为1.0 mg/ ml的标准贮备液，分别吸取0、20、40、60、80、100 μl于10 ml容量瓶中，用无水乙醇定容至10 ml，该系列溶液的浓度分别为0、2、4、6、8、10 μg/ml。利用UV-2800紫外分光分光度计，选择λmax=265 nm，以空白溶液调零后，对0、2、4、6、8、10 μg/ml的标准系类溶液进行测定，仪器自动以浓度—吸光度绘制标准工作曲线;然后以样品空白溶液调零后，直接测定各样品溶液大豆异黄酮的浓度(每个读数测定五次取平均值)，并根据测定浓度、样品体积、样品质量分别计算出发酵豆粕、豆粕、大豆中大豆异黄酮的含量。

3 结果与讨论

3.1 标准大豆异黄酮及样品紫外区扫描曲线见图1。

图1 标准大豆异黄酮、大豆、豆粕及发酵豆粕扫描图谱1.大豆异黄酮标准(8μg/ml)2.发酵豆粕3.黄豆4.豆粕

由图1可见，在265nm处大豆、豆粕及发酵豆粕均有与标准大豆异黄酮类似的特征吸收，所以可选择λ265nm作为测定波长。

3.2 大豆异黄酮标准曲线及各样品大豆异黄酮含量见图2，表2。

图2 大豆异黄酮标准工作曲线

表2 样品中大豆异黄酮含量

由表2数据可得，发酵豆粕大豆异黄酮提取率是未经发酵豆粕提取率的1.76倍，大豆提取率的1.26倍。发酵豆粕成本低且大豆异黄酮提取率高，以发酵豆粕为提取大豆异黄酮原料，既可增加豆粕附加值又可节约大豆资源，具有广阔的市场空间。

3.3 大豆异黄酮单因素试验结果

3.3.1 超声波处理时间对大豆异黄酮提取率的影响见图3。

图3 提取时间对大豆异黄酮提取率的影响

从图2可以看出，超声波处理时间少于1.5 h时，处理时间越长异黄酮得率越高，1.5 h时，多糖得率达到最高;而后随着处理时间的延长，异黄酮得率开始下降。原因可能是超声波具有较强的机械剪切作用，长时间的作用会使破坏异黄酮分子结构，处理时间过长影响异黄酮得率。因此，选取超声波处理时间1 h、1.5 h、2.0 h三个水平进行大豆异黄酮提取的正交试验。

3.3.2 提取温度对大豆异黄酮提取率的影响见图4。

图4 提取温度对大豆异黄酮提取率的影响

由图3可知，从60～90℃，随着温度的升高大豆异黄酮的提取得率先增大后减小，因此，选取60℃、70℃、80℃作为温度的三水平进行大豆异黄酮提取的正交试验较为合理。

3.3.3 料液比对大豆多糖提取得率的影响见图5。

图5 料液比对大豆异黄酮提取率的影响

由图4可以看出，料液比在1：5～1：20时，大豆异黄酮提取率随料液比的增大而增大;料液比在1：10～1：15时，大豆异黄酮提取率趋于平缓，同时因料液比的增大会增加浓缩的困难，因此，选择料液比1：10、1：15、1：20三个水平进行大豆异黄酮提取的正交试验。

3.3.4 不同乙醇浓度对大豆异黄酮提取得率的影响见图6。

图6 乙醇浓度对大豆异黄酮提取率的影响

由图5可以看出，随着乙醇浓度的增加，大豆异黄酮提取率增加，95%乙醇与无水乙醇的提取率近似，因此，选取乙醇浓度为70%、80%、95%三个水平的乙醇浓度进行正交试验。

3.4 大豆异黄酮正交试验结果见表3。

表3 正交试验结果

由表3极差分析可知，影响大豆异黄酮提取率各因素主次关系为:超声波提取时间＞提取温度＞乙醇浓度＞料液比，且分别以第二水平、第三水平、第一水平和第二水平为佳，因此根据极差结果，得出大豆异黄酮的最优浸提工艺参数A2B3C1D2，即提取时间为1.5h、料液比为1:10、乙醇浓度为95%、提取温度为70℃时，发酵豆粕中大豆异黄酮含提取率最高。

优化条件下重复性试验结果:从表3可以看出，在正交优化条件下做重现性试验，相对标准偏差为2.151%，小于5%，表明优化条件下的可行性和重现性较好，此时大豆异黄酮提取率达0.327%。

本研究充分证明了以发酵豆粕作为大豆异黄酮提取原料的可行性，并且探究出了优化的提取工艺，结合豆粕廉价易得的特点，利用豆粕发酵作为大豆异黄酮的提取原料，大大降低了大豆异黄酮的生产成本，节约了大豆资源，同时提高了豆粕的附加值。本研究对豆粕进一步加工利用提供了可靠的实验依据，对促进大豆产业的发展具有重要意义。

［1］Riaz M.Soybeans as Funetional Foods［J］.Cereal Foods World，1999，44(2):88-92.

［2］井乐刚，张永忠，杨健.大豆异黄酮在保健食品和医药中应用的研究进展［J］.植物学报，2002，19(6):692-697.

［3］Kim JJ，Kim SH，Hahn SJ，et al.Changing soybean isoflavone composition and concentrations under two different storage conditions over three years［J］.Food Research International，2005，38:435-444.

［4］Kim JS，Kwon CS.Estimated dietary isoflavone intake of Korean population based on National Nutrition Survey［J］.Nutrition Research，2001，21:947-953.

［5］吴小刚，曾莹.β-葡萄糖苷酶高产菌的筛选［J］.中国酿造，2005，20(9):142161.

［6］朱熹，田慧云.混合发酵去除豆粕中抗营养因子最佳发酵条件的探究［J］.养殖与饲料，2007，15(1):9-12.

The extraction and content determination of soybean isoflavonesin in the fermented soybean meal

ZHANG Xiao-zheng XING Peng-rui ZHANG Xian-xiang YU Xin ZHU Wei-wei YANG Zhi-xiao
(Taishan Medical University，Taian 271016，China)

Objective:To extract soybean isoflavones from fermented soybean meal by ultrasonic method，and investigate the best extraction conditions.Methods:Soybean meal was fermented by the method of microorganism fermentation，then ultrasound and solvent extraction method was used to extract soybean isoflavones in soybean meal fermentation.The best extraction conditions were explored through single factor and orthogonal test.Finally，ultraviolet spectrophotometry was used to determine content.Results:The content of soybean isoflavones in the fermented soybean meal was 3.27mg/g，soybean meal＇s content was 1.86mg/g and soybean＇content was 2.59mg/g.Conclusion:Fermented soybean meal can be a good raw material to extract soybean isoflavones，and enhances the additional value of the soybean meal，which can save limited resources of soybean.

fermented soybean meal;soybean isoflavones;ultrasonic extraction

R271.9

A

1004-7115(2015)01-0057-04

10.3969/j.issn.1004-7115.2015.01.020

2014-10-17)

山东省青少年科学研究所项目基金(13DJS072)。

张晓峥(1992-)，女，泰山医学院2010级临床医学与英语专业。

杨志孝，zxyang@tsmc.edu.cn。