五味贞甘饮品对化学性肝损伤有辅助保护作用功能学评价

于 珊,张凤清,解耸林

(长春工业大学化学与生命科学学院,吉林长春 130012)

五味贞甘饮品对化学性肝损伤有辅助保护作用功能学评价

于 珊,张凤清*,解耸林

(长春工业大学化学与生命科学学院,吉林长春 130012)

探讨五味贞甘饮品对化学性肝损伤的辅助保护功能。将清洁级Wistar雄性大白鼠分为5组:空白对照组、模型对照组、五味贞甘饮品低剂量组、中剂量组、高剂量组。连续灌胃大鼠30d,除对照组外以CCl4制备急性肝损伤大鼠模型,并测定ALT、AST值,取肝脏作病理切片,观察肝脏的病理损伤情况。结果显示:高、中剂量组的ALT、AST均低于CCl4肝损伤模型组,差异有显著性(p<0.01),高剂量组大鼠病理总积分较CCl4肝损伤模型组轻,差异有显著性(p<0.01)。结论:五味贞甘饮品对化学性肝损伤有辅助保护功能。

五味贞甘饮品,化学性肝损伤,CCl4

五味贞甘饮品是以五味子、女贞子、甘草、葛根为主要原料,辅以对羟基苯甲酸乙酯、木糖醇制成的保健饮品。目前已通过毒理学评价证明其安全无毒,根据《保健食品检验与评价技术规范》,考察五味贞甘饮品对以CCl4为模型的化学性肝损伤的辅助保护作用,为保健食品功能学申报提供技术支持。配方采用中医配伍的原则,其中五味子为君药,葛根为臣药,佐药为女贞子和甘草。国内外学者对配方中的各味药材研究表明配方中各味药材均对肝损伤有保护作用。现代药理学研究表明,五味子对中枢神经系统、心血管系统、免疫系统等均有调节作用,同时还发现其在抑制肿瘤、保护肝脏、抗氧化、抗衰老等方面也有作用[1]。五味子对CCl4引起的化学性肝损伤具有一定的保护作用[2-3]。葛根保肝机制可能与葛根的保护肝细胞膜、清除自由基、抗纤维化等作用有关[4]。葛根素对肝脏有保护和修复的作用[5-6]。吕娟涛、汤浩通过实验结果表明,女贞子多糖能不同程度的改善肝组织病理变化[7]。陈红艳等经过实验表明甘草提取物对四氯化碳所致小鼠急性化学性肝损伤具有保护作用[8]。化学性肝损伤由化学性肝毒性物质所造成的肝损伤。在被调查的我国人群中,亚健康的发生率约为58.18%,其中肝脏损伤人数达1.3亿人,由于肝损伤病症导致死亡的人数近50万人。所以,对化学性肝损伤有辅助保护功能的保健饮品的研制有很好的市场前景。本实验通过建立大鼠急性CCl4肝损伤模型,通过检测其血清中ALT、AST的含量和病理检测来研究五味贞甘饮品对化学性肝损伤的辅助保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

五味子,女贞子,葛根,甘草 购于同仁堂药店；对羟基苯甲酸乙酯 天津市北辰方正试剂厂,分析纯；氢氧化钠 北京化学试剂厂,分析纯；四氯化碳 北京化工厂,分析纯；蒸馏水。

ALT试剂盒、AST试剂盒 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；日本东芝TBA-120FR全自动生化分析仪；D75-3型低速台式自动平衡离心机 北京时代北利离心机有限公司；T1000型电子天平 常熟双杰测试仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 五味贞甘饮品制备 五味子、葛根、女贞子、甘草→水提→提取液→减压浓缩→浓缩液Ⅰ→醇沉→浓缩液Ⅱ→调配→灌装→灭菌→成品

提取:每瓶五味贞甘饮品含五味子2g,葛根4g,女贞子3g,甘草2g,加入10倍量水(mL/g),煎煮3次,每次2h,煎液滤过,合并滤液,滤液减压浓缩(60℃,-0.08MPa)至相对密度为1.10～1.15(60℃),得到浓缩液Ⅰ。

醇沉:量取适量95%乙醇,搅拌加入到浓缩液Ⅰ中,使含醇量达70%,静置24h,过滤,滤液,回收乙醇并浓缩至相对密度1.10～1.15(60℃),得到浓缩液Ⅱ。

配制:将浓缩液Ⅱ加纯化水至近配方量,搅拌混合30min使均匀,冷藏(4～8℃)24h,过滤(300目),收集滤液；对羟基苯甲酸乙酯用适量乙醇溶解,溶液备用；取对羟基苯甲酸乙酯乙醇溶液、处方量木糖醇6g,加入到滤液中,用10%氢氧化钠溶液调pH为6.5～7.0,加水至足量,搅拌混合30min使均匀,过滤(300目)。

灌装:灌封,100mL/瓶。推荐成人(体重按60kg计)日摄入量为每日1瓶,100mL/瓶,即100mL/60kg·BW。

灭菌:灭菌条件为115℃ 30min。

1.2.2 动物实验及分组 Wistar雄性大白鼠50只(“SPF级”由“吉林大学白求恩医学院动物实验中心提供”),随机分为对照组、CCl4肝损伤模型组及五味贞甘饮品高、中、低剂量组,每组雄性大鼠10只。以浓配液(1∶16)为样品,即0.104mL/kg BW,高、中、低剂量组分别给予成人日摄入浓配液量的30倍、10倍、5倍即3.12、1.04、0.52mL/kg BW(按31.2、10.4、5.20mL分别加蒸馏水至100mL的量配药)。各组均按1.0mL/100g BW的量灌胃。实验期间受试物各剂量组灌胃给予不同剂量的五味贞甘饮品,连续灌胃30d,正常对照组及CCl4肝损伤模型组灌胃给予蒸馏水。大鼠灌胃30d后,将各组动物隔夜禁食16h,模型组及各样品组一次灌胃给予CCl4,以3.2% CCl4(用植物油稀释)作为肝脏毒物建立急性化学性肝损伤模型,灌胃量5mL/kg BW。正常对照组给予植物油,受试组继续给予五味贞甘饮品至实验结束(与CCl4灌胃间隔4.5h)。给予CCl4后24h用1%戊巴比妥钠生理盐水溶液,按5mL/kg BW腹腔注射麻醉后,下腔静脉采血,分离血清,测定ALT、AST值,并取肝脏作病理切片,观察肝脏的病理损伤情况。病理组织学观察以肝细胞“气球样变、脂肪变性、胞浆凝聚、水样变性、细胞坏死”等作为观察指标,并根据每种病变程度进行量化。

1.2.3 大鼠血清中ALT、AST含量的测定 大鼠腹腔取血后,静置,3000r/min,离心15min,用自动生化分析仪测定血清生化指标的活性。

1.2.4 大鼠肝脏的病理分析用 10%福尔马林固定肝脏组织块,包埋,切片,采用HE染色方法进行常规病理检查,观察肝细胞病理情况。

1.2.5 统计学处理方法 数据以平均值±标准差(x±s)表示,用SPSS 11.5统计软件进行t检验,p<0.05表示有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 五味贞甘饮品对大鼠体重的影响

由表1可见,经过给予不同剂量的五味贞甘饮品30d,各剂量组、模型组与正常对照组比较,动物体重、增重差异无显著性(p>0.05)。

表1 五味贞甘饮品对动物体重的影响Table 1 Effect of Mixed zhen gan drinks on the level of weight in rats

2.2 五味贞甘饮品对动物血清中ALT、AST的影响

由表2可见,CCl4肝损伤模型组的ALT、AST均高于正常对照组,差异有显著性(p<0.01),说明模型成立；五味贞甘饮品高、中剂量组的ALT、AST 均低于CCl4肝损伤模型组,差异有显著性(p<0.01),其中五味贞甘低剂量组的ALT值与CCl4肝损伤模型组无显著性差异,但是其ALT的值低于CCl4肝损伤模型组,并且随着五味贞甘饮品浓度的增加ALT、ALS的值变低。

2.3 五味贞甘饮品对肝脏病变的影响

由镜检结果可见,正常对照组的病理积分明显低于CCl4模型组,差异性显著(p<0.01),说明模型成立。五味贞甘饮品高剂量组的病理总积分低于CCl4模型组,差异性显著(p<0.01),五味贞甘饮品低、中剂量组的病理总积分与CCl4模型组相比差异虽没有显著性,但其病理总积分

表2 五味贞甘饮品对大鼠血清ALT、AST的影响Table 2 Effect of Mixed zhen gan drinks on the level of Serum ALT and AST in rats

注:**表示 CCl4模型组比较有显著差异(p<0.01)。

表3 病理积分Table 3 Pathologic total points

注:总分的计算方法为,将各种病理变化的得分相加。*表示与CCl4模型组比较有显著性差异(p<0.05)；**表示与CCl4模型组比较有显著性差异(p<0.01)。

均低于CCl4模型组,且随着五味贞甘饮品的浓度增加其总积分的数值下降。五味贞甘高剂量组的气球变性病理积分低于CCl4模型组,差异性显著(p<0.05),五味贞甘高剂量组的细胞坏死病理积分低于CCl4模型组,差异具有显著性(p<0.01),各剂量组的水样变性、脂肪变性、胞浆凝聚与CCl4模型组虽没有显著降低,但随着剂量的增加病变也相对减轻。

3 结论

四氯化碳是一种选择性的肝毒性物质,是目前诱导肝细胞损伤的常用化学毒物,可将其溶于甘油、花生油、石蜡油、棉籽油等,经口服、腹腔注射、皮下注射等途径制备肝损伤模型[9]。实验采用3.2% CCl4植物油溶液按5mL/kg BW进行灌胃,成功地建立了肝损伤模型。

肝损伤是多因素参与的一个复杂病理过程,在其病变过程中多种酶、自由基以及脂质过氧化反应均发生着较大的变化[10-13]。CCl4诱导的肝损伤模型是研究药物保肝活性的常用模型。当CCl4诱导的急性肝细胞损伤发生时,谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)从肝细胞内释放至血清中,导致血清中ALT 和AST 活性的升高,所以血清中ALT 和AST 是急性肝损伤的敏感指标,其升高在一定程度上说明了肝脏受损的程度[14]。实验结果显示五味贞甘饮品的各剂量组与模型组和正常对照组比较,动物体重、增重没有显著差异,CCl4肝损伤模型组的ALT、AST均高于正常对照组,差异性显著(p<0.01),病理积分明显高于对照组,差异性显著(p<0.01),说明模型成立。五味贞甘饮品的高、中剂量组的ALT、AST均低于CCl4肝损伤模型组,差异性显著(p<0.01)。高剂量组的病理总积分低于CCl4模型组,差异性显著(p<0.01),并且高剂量组与CCl4模型组相比气球变性、细胞坏死病理积分及病理总积分明显下降,且高、中、低剂量组均呈剂量反应关系,其它病变类型与CCl4模型组相比也有减轻。说明五味贞甘饮品对化学性肝损伤有辅助保护作用。

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Evaluation of the effect ofmixed zhen gan drinks on chemical liver injury

YU Shan,ZHANG Feng-qing*,JIE Song-lin

(College of Chemistry and Life Science,Changchun University of Technology,Changchun 130012,China)

To explore the protective effect on chemical liver injury of Mixed zhen gan drinks. Male Wistar rats were divided into 5 groups:blank group,model group and mixed zhen gan drinks with low dose group,middle dose group and high dose group. Each group was ntragastric administration for 30d,the acute hepatic injury model was made by CCl4except the control group,the level of ALT and AST was detected and pathology were carried out. Results:Level of ALT and AST in high and middle dose group was lower than that of CCl4hepatic injury model group with significant difference(p<0.01),rat pathologic total points of high dose group was lighter than CCl4hepatic injury model group with significant difference(p<0.01). Conclusion:Mixed zhen gan drinks had auxiliary protection effect on chemical liver injury。

Mixed zhen gan drinks；liver injury；CCl4

2014-03-24

于珊(1989-),女,硕士研究生,研究方向:保健食品开发。

*通讯作者:张凤清(1967-),女,硕士,教授,研究方向:保健食品开发。

TS201.4

A

1002-0306(2015)03-0360-03

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.069