两亲性聚乙烯亚胺修饰量子点构建功能性光学探针用于干细胞治疗的示踪研究＊

温 清，刘人恺，王志勇

1广东医学院附属南山医院神经内科，深圳 518052

2中国科学院深圳先进技术研究院，保罗·C·劳特伯生物医学成像研究中心，深圳 518055

两亲性聚乙烯亚胺修饰量子点构建功能性光学探针用于干细胞治疗的示踪研究＊

温 清1，刘人恺1，王志勇2△

1广东医学院附属南山医院神经内科，深圳 518052

2中国科学院深圳先进技术研究院，保罗·C·劳特伯生物医学成像研究中心，深圳 518055

目的 制备新型分子影像探针标记间充质干细胞，以实现细胞荧光成像。方法 应用1－碘十二烷修饰聚乙烯亚胺，构建两亲性大分子。利用大分子自组装性能，包裹疏水性核壳结构CdSe／CdS量子点构建纳米探针。结果 该探针在630nm处呈现出较强的荧光信号，能够促使间充质干细胞高效内吞。体内成像结果显示，与空白对照细胞相比，被标记细胞呈现出显著的光学信号，空白组信号值为1.47e8［p／s／cm2／sr］／［μW／cm2］，实验组信号值为2.78e8［p／s／cm2／sr］／［μW／cm2］。结论 该纳米探针具有良好光学成像性能，可实现细胞标记。

聚乙烯亚胺； 量子点； 荧光成像； 干细胞治疗

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是老年期临床常见病和多发病，表现为执行功能障碍、记忆力衰退、认知功能缺陷等症状。其病理改变，主要以神经炎性斑、神经元纤维缠结和神经元的缺失、死亡为主［1］。目前，临床用于治疗的药物主要包括胆碱酯酶抑制剂、抗自由基药物、能量代谢促进剂或促智药物等，虽然药物能够延缓病变发展，但无法弥补脑实质性损伤，因此对于中晚期患者难以取得有效的病理恢复［2］。近年来，研究人员发现干细胞（stem cell）表现出低免疫原性、多潜能分化、自我更新以及定向迁移等生物学特性，能够对机体各组织器官的损伤进行修复，这使得干细胞成为AD治疗的新希望［3］。有报道显示，干细胞植入阿尔茨海默病模型大鼠后，模型鼠的海马区神经元数目增多，并且移植的干细胞修复了原有损伤和坏死的神经元细胞，同时重建了神经通路，结果表明干细胞治疗后患病大鼠的记忆和学习能力均有显著提高［45］。

虽然干细胞移植备受瞩目，然而观测细胞体内分布规律非常困难，这对于疾病的治疗评价造成困扰［5］。随着分子影像（molecular imaging）技术的发展，研究人员采用影像方法，结合分子探针实现了对活体状态下的组织、细胞与分子水平的信号采集，完成了针对被检测目标的定性和定量信息分析［6］。其中，运用光学分子影像技术，通过构建光学分子探针对干细胞进行标记，能够实现对移植干细胞的实时示踪，进而完成对体内干细胞生物学行为的无创性高效评估。光学分子影像需要制备高效的光学探针，半导体量子点（quantum dots，QDs）是近几年兴起的一种由Ⅱ～Ⅵ族或Ⅲ～Ⅴ族元素组成的准零维半导体纳米晶体，具备特殊的尺寸和界面效应，表现出独特的光学性质［7］。本研究将使用聚乙烯亚胺（polyethyleneimine，PEI）修饰量子点，构建高性能纳米探针，实现干细胞标记。

1 材料与方法

1.1 Dodecyl－PEI／QDs纳米复合物的制备

依据文献合成量子点纳米晶体［8］，方法如下:首先制备CdSe核部，而后利用层层晶体生长法构建CdSe／CdS核壳结构纳米QDs晶体。将制备的QDs分散在三氯甲烷溶液中避光保存。依照项目组先前文献报道［9］，应用1－碘十二烷（1－iodododecane）对聚乙烯亚胺（PEI）进行修饰，构建成Dodecyl－PEI大分子。待大分子合成后，取一定量分散在三氯甲烷中的QDs纳米晶体，按照QDs与大分子质量比1∶2.5的比例，加入所需1－碘十二烷修饰的聚乙烯亚胺（Dodecyl－PEI），将混合物在超声条件下滴加到水中，利用亲疏水作用力自发形成纳米颗粒。将构建的纳米复合物溶液通过旋转蒸发方法移除三氯甲烷溶剂，得到Dodecyl－PEI／QDs纳米探针溶液。针对制得的Dodecyl－PEI／QDs纳米探针应用动态光散射（Malvern公司，zetasizer NanoZS仪器）、荧光分光光度计（HITACHI公司，FL7000仪器）、紫外－可见光分光光度计（Perkin Elmer公司，Lambda仪器）进行检测。

1.2 细胞标记与细胞影像学分析

取小鼠骨髓间充质干细胞（MSCs），应用含10%胎牛血清、100U／mL青霉素和100U／mL链霉素的α－MEM培养液进行培养。待干细胞传至第3代时用于实验研究。以细胞密度1×105个／mL接种到培养瓶中进行常规培养。24h后换入新鲜培养液，加入Dodecyl－PEI／QDs纳米探针（其中QDs浓度20mg／mL），探针与细胞孵育2h后更换培养液。继续培养22h后使用PBS缓冲液清洗，应用4’，6－二脒基－2－苯基吲哚（4’，6－diamidino－2－phenylindole，DAPI）对细胞核进行染色，将被标记细胞置于激光共聚焦扫描显微镜下，对量子点标记的MSCs进行观测。

1.3 细胞标记与细胞影像学分析

将探针标记的MSCs在BALB／c小鼠背部皮下右侧注入；小鼠左侧背部对照组注射空白MSCs。细胞注射数目为106个。细胞注射后24h应用Xenogen IVIS－100系统进行小动物体内荧光成像检测，成像参数:Ex＝500nm，Em＝620nm。

2 结果

2.1 QDs纳米探针性能分析

疏水性量子点由于其纳米尺寸效应呈现出特殊的紫外吸收峰和荧光光谱。如图1所示，QDs具有约6nm尺寸且在可见光光谱图上613nm处呈现第一吸收峰（图1A），并且经由488nm激发光激发于630nm处呈现出显著的荧光光谱（图1B）。然而，这些有机相合成的QDs由于分散在弱极性的三氯甲烷中无法满足生物学需求，需要经由化学修饰将有机相QDs转移至水相中。两亲性Dodecyl－PEI具有极性溶剂（水溶液）中的自组装效应，可以自发形成以长链烷烃构建的中心疏水区域，周围为亲水性氨基的纳米胶束结构。在核心的疏水区域可以有效装载疏水性QDs，构建Dodecyl－PEI／QDs纳米探针，该探针的紫外、荧光光谱和原始有机相中的QDs光谱几乎相重合，由于两亲性分子的包裹效应造成粒度增加到约为8nm（图1C），且在水溶液中呈现出约＋40mV电压。利用小动物荧光成像检测，该纳米探针具有优良的成像性能，即使在QDs浓度为0.001 5mg／mL，仍表现出显著的光学信号值（图1D）。

2.2 QDs纳米探针标记间充质干细胞体外检测

应用该纳米探针对MSCs进行标记，应用激光共聚焦显微镜检测如图2所示，通过DAPI对细胞进行染色后细胞核呈现蓝色光，量子点呈现出红色光，结果显示纳米探针主要集中在干细胞的胞质中。

2.3 QDs纳米探针标记MSCs体内检测

应用小动物光学成像仪对注射有MSCs的小鼠进行光学成像，如图3所示。小鼠皮下双侧注射有干细胞，左侧为未标记的干细胞，右侧为使用QDs探针标记的干细胞。成像显示，被标记的干细胞仍具有有效的光学效应，其成像信号值约为左侧对照组的2倍，空白细胞光学数值为1.47e8［p／s／cm2／sr］／［μW／cm2］，而标记细胞注入部位光信号有所增高，其光学数值为2.78e8［p／s／cm2／sr］／［μW／cm2］。

图1 Dodecyl－PEI／QDs纳米探针的光学性能Fig.1 Optical properties of Dodecyl－PEI／QDs nanoprobes

图2 被探针标记的MSCs激光共聚焦成像Fig.2 Confocal scanning laser microscopy of mesenchymal stem cells labeled with the probes（bar＝25μm）

3 讨论

以往研究人员主要依靠活体采样并结合组织切片检测干细胞治疗中细胞迁移效率和细胞功能［10］，但是受制于采样范围的局限性难以获取全面而可靠的信息。分子影像技术的出现，有望对干细胞治疗进行无创性探测，并对细胞的活动情况实时监控。在众多的分子影像技术中，荧光分子成像技术（fluorescence molecular tomography，FMT）具备非电离、无辐射、高通量、高灵敏度及低成本等优点。针对干细胞的荧光成像，需要利用外部光源激发生物体内的荧光标记物，能够获得成像信号［7］。

目前，实验中常见荧光标记物主要为有机小分子，然而，由于这些小分子存在激发光谱窄并且光漂白抗性差，无法满足细胞治疗的长时间与高稳定性的监测要求。相比而言，QDs具有较强的光稳定性、宽的激发谱和窄的发射谱，并拥有较大的斯托克斯位移和较长的荧光寿命。这些优良的光学成像性能使得QDs在细胞标记与示踪研究上备受人们关注。在QDs的应用研究中，保持纳米粒子的单分散性是制备过程中的一个难题。利用PEI阳离子高分子对纳米晶体进行修饰，已经在可视化基因／药物递送应用中得到了广泛应用。PEI是生物学领域中广泛使用的阳离子大分子。由于具备伯、仲、叔氨基结构，PEI在水溶液中呈现出正电性，这能够促进与呈负电的细胞膜实现吸附，进而增强细胞内吞。然而，分子量高的PEI具有较强的正电性可以有效附着在细胞膜上，但却具有高细胞毒性，制约了其临床应用潜能。相比而言，低分子量的PEI细胞毒性小。

本研究中，利用疏水性烷基基团成分修饰低分子量PEI，以此构建两亲性分子，借助亲疏水自组装性能，构建了一种高电荷密度的纳米结构，利用疏水成分形成的内核包裹疏水性的QDs。由于该组装过程为熵驱动下的物理自发过程，不会对QDs原有化学结构造成破坏，因此，相转移前后QDs的物理光学性质未发生改变（图1）。由于亲水性氨基基团暴露于探针表面，使得水溶液环境中该纳米探针呈现出正电性，这有助于在细胞表面的吸附，促使细胞内吞完成标记工作。在激光共聚焦图片中（图2），大量的QDs探针出现在细胞胞质中，呈弥散状分布，被标记干细胞并未表现出萎缩等病态。应用该纳米探针标记的MSCs通过皮下注射注入小鼠体内，经小动物光学成像仪扫描，小鼠背部被标记MSCs注射部位呈现显著光学信号。文献报道的经由PEI修饰的超顺磁四氧化三铁（SPIO）材料构建的磁共振探针，通过标记MSCs可以在磁共振下监测细胞存在的部位［11］。

本研究所建立的QDs光学探针，以及前期报道的磁共振探针［12］，虽然能够实现被标记细胞所在部位成像，然而，如何监测细胞生存状态仍然是个难题。加之，由于细胞自身凋亡、代谢、胞吐等生物学过程，极易造成探针与细胞的脱离，在图像上极易形成假阳性结果。目前，能够对细胞生存状态进行检测的影像学方法，仅仅有生物发光成像（Bioluminescence）一种，该方法依据细胞内产生的荧光素酶（Luciferase），利用氧和ATP并在外源性底物作用下形成光源［13］。但是，由于该方式需借助具备荧光素酶的细胞，才能够对细胞生长及转移等发展过程进行定量、定性观测。然而，哺乳动物并不具备荧光素酶基因，实验中需要基因改造才能实现监测目的，造成该成像模式的临床应用前景黯淡。未来，针对纳米探针考虑利用生物活性成分进行成像研究，或许是分子影像的重要发展方向［1415］。

综上所述，本研究采用Dodecyl－PEI包裹QDs形成纳米复合物，具有较高的细胞标记效果，并且被标记细胞能够在小鼠皮下组织中形成光学成像示踪效果。该纳米颗粒可作为潜在的光学探针，并有望在细胞治疗示踪方面得到进一步应用与发展。

图3 小动物荧光成像Fig.3 Fluorescence imaging of small animals

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（2014－07－22 收稿）

Stem Cell Tracking with Amphiphilic Polyethyleneimine Modified Quantum Dots as Functional Optic Probes

Wen Qing1，Liu Renkai1，Wang Zhiyong2△1Department of Neurology，Nanshan Affiliated Hospital of Guangdong Medical College，Shenzhen 518052，China
2Shenzhen Institutes of Advanced Technology，Chinese Academy of Sciences，Paul.C.Lauterbur Research Center for Biomedical Imaging，Shenzhen 518055，China

Objective Stem cell therapy has been extensively used in clinical practice.However，the methods available are unable to non－invasively detect the distribution of cells in vivo.This study was aimed to establish a novel molecular imaging probe for stem cell labeling，which would monitor cells via fluorescence imaging.Methods 1－iodododecane was used to modify polyethyleneimine（PEI）to form amphiphilic macromolecules.These macromolecules encapsulated the hydrophobic quantum dots by self－assembly to form imaging probes.Results Strong fluorescence signals of the probe occurred at 630nm，and the probe could be effectively endocyted by mesenchyme stem cells.In vivo imaging showed that significant optic signals occurred in probe－labeled mesenchyme stem cells compared with the control cells（blank group:1.47e8［p／s／cm2／sr］／［μW／cm2］；test group:2.78e8［p／s／cm2／sr］／［μW／cm2］）.Conclusion The nanoprobes have good optic imaging effects，and can be used to label cells.

polyethyleneimine； quantum dots； fluorescence imaging； stem cell therapy

R329.28

10.3870／j.issn.1672－0741.2015.01.005

＊深圳市科技计划资助项目（No.201203213）

温 清，男，1965年生，副主任医师，E－mail:sznswq＠163.com

△通讯作者，Corresponding author，E－mail:zy.wang＠siat.ac.cn