探讨miRNA表达比在多发性骨髓瘤中的预测作用

刘 波，李世龙，尤建宇，陈文忠，于 涛

（吉林大学中日联谊医院，吉林长春130033）

探讨miRNA表达比在多发性骨髓瘤中的预测作用

刘 波，李世龙，尤建宇，陈文忠，于 涛＊

（吉林大学中日联谊医院，吉林长春130033）

目的探讨miRNA（微小RNA）表达比在多发性骨髓瘤患者血浆中的预测作用。方法收集24例MM患者及30例正常对照的血浆标本，运用高通量芯片的方法将差异表达的miRNA进行筛选；对分析结果进行qRT－PCR验证；用ROC曲线分析了miRNA表达比，找出最具预测潜能的组合型标志物。结果与正常血浆标本相比，基因芯片检测出178个差异表达的miRNA，选取其中4个miRNAs在24例MM血浆标本和30例正常血浆标本进行验证。其中miR－21在多发性骨髓瘤中比在正常人中有明显的高表达，而miR－199a－5p，miR－16和miR－125a－5p在多发性骨髓瘤中则是低表达；miR－21／miR－199a－5p的表达比表现出很高的灵敏度和特异度，可以作为诊断多发性骨髓瘤的组合型生物标志物。结论miR－21／miR－199a－5p表达比或许可以成为预测多发性骨髓瘤的生物标志物。

微小RNA；多发性骨髓瘤；生物学标记

（Chin J Lab Diagn，2015，19：0259）

多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）为骨髓恶性浆细胞异常增生的血液系统恶性疾病，其发病率仅次于白血病，居血液系统恶性疾病的第二位。尽管治疗策略已从化疗、自体造血干细胞移植演变为靶向药物治疗，使得多发性骨髓瘤的预后得到了显著的改善，但多发性骨髓瘤仍是不可治愈的肿瘤之一。诸多研究已经表明，miRNA广泛参与肿瘤的发生、发展及预后［1］，很可能是一类潜在的癌基因［2，3］或抑癌基因［4］，亦可以作为诊断或预后的生物标志物［5，6］。本研究旨在检测miRNA表达比在多发性骨髓瘤血浆中的预测作用。

1 材料与方法

1.1 研究对象

24例多发性骨髓瘤血浆标本来自吉林大学中日联谊医院血液内科，30例健康对照组血液标本来自吉大中日联谊医院门诊非恶性血液病病人的血浆标本，空腹抽取静脉血4ml，用含EDTA抗凝剂的采血管采集。所有患者均符合张之南等主编的《血液病诊断和疗效标准》（1998年）中提出的MM诊断标准及疗效标准，患者知情同意。

1.2 主要材料和试剂

RNA提取所需TRLzol reagent以及电泳所需琼脂糖购自Invitrogen（美国）公司。SYBR Premix Ex TaqⅡ、SYBR○RPrimeScript○RmiRNA RT－PCR Kit（Perfect Real Time）试剂盒均购自苏州吉玛公司。基因表达谱芯片及miRNA芯片为Illumina芯片（美国）。三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇购自天津化学试剂公司，DEPC处理水购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

1.3 RNA的提取及逆转录

将裂解血按照TRLzol reagent（Invitrogen）说明书进行RNA抽提，按照Takara逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA，－20℃保存.

1.4 芯片制备

将制备好血浆cDNA与杂交试剂混合，加入GEX－HBY和RNA－FREE水进行杂交。样本经过室温孵育、洗涤、干燥后，进行扫描及分析。

1.5 分析方法

使用lllumina BeadChip Reader对芯片进行读取并获取图像，用lllumina BeadStudio Application分析数据。以正常血浆组为对照组，多发性骨髓瘤血浆组为实验组，实验组相对于对照组的差异表达作为差异miRNA。

1.6 qRT－PCR验证差异表达miRNA

用荧光定量PCR仪（Stratagene MX3000P日本）对差异表达miRNA进行验证，U6作为内参。hsamiR－21引物序列：UAGCUUAUCAGACUGA UGUUGA。hsa－miR－199a－5p引物序列：CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC。hsa－miR－16引物序列：UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG。hsa－miR－125a－5p引物序列：UCCCUGAGACCCUUUAACCUGUGA。扩增条件：95℃预变性30s，95℃变性20 s，60℃退火延伸30s，50个循环。

1.6 统计学分析

使用SPSS18.0统计软件进行统计学处理。ROC曲线采用MedCalc软件。芯片数据采用单因素方差分析。P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 多发性骨髓瘤血浆标本中miRNA的差异表达

与正常血浆标本相比，在多发性骨髓瘤血浆标本中共有178个差异表达miRNA，其中上调的62个，下调的116个（P＜0.05），见表1。

表1 基因芯片中miRNA的差异表达

2.2 实时荧光定量PCR验证4个差异表达的miRNA

实时荧光定量PCR验证结果显示miR－21表现出明显的上调趋势（P＜0.05），而miR－199a－5p，miR－16和miR－125a－5p则表现出显著的下调趋势（P＜0.05），本结果与芯片结果一致，见图1。

2.3 miRNA表达比的筛选

为了确定miRNA表达比在多发性骨髓瘤中的预测价值，采用Gordon等［5］的方法，将唯一上调的miR－21和3个下调的miRNA做比值，用ROC（受试者工作特征曲线）来确定哪组表达比具有最大的预测潜力（图2）。发现miR－21／miR－199a－5p具有96%的灵敏度和100%的特异度（P＜0.05），而miR－21／miR－16的灵敏度和特异度均较差，miR－21／miR－125a－5p的特异度较差（表2）。后两者均不适合作为诊断多发性骨髓瘤的肿瘤标志物。

图1 四个差异表达的miRNA

3 讨论

多发性骨髓瘤是一种源发于免疫系统淋巴细胞的恶性肿瘤。目前多发性骨髓瘤发病机制不清，治疗效果不理想。因此寻找预测多发性骨髓瘤发病风险的肿瘤标志物极具有临床推广价值。许多研究已经证实，miRNA与肿瘤进展密切相关并对疾病的预后有预测价值［7－9］。

表2 三种miRNA表达比的灵敏度和特异度

图2 3种miRNA表达比的ROC曲线图

本研究对收集的多发性骨髓瘤血浆标本进行miRNA芯片检测，发现了共有178个差异表达的miRNA。miR－21表现出明显的上调趋势，而miR－199a－5p，miR－16和miR－125a－5p则表现出显著的下调趋势。在24个多发性骨髓瘤血浆标本里进行实时荧光定量PCR验证，结果显示与芯片结果趋势一致，从而进一步证实了miRNA做为多发性骨髓瘤诊断的生物标志物的可能性。Michele等［10］证实头颈部肿瘤中的miR－221／miR－375表达比具有93%的特异度和92%的灵敏度，故可作为头颈部肿瘤诊断的生物标志物。本实验的创新点在于明确了多发性骨髓瘤患者的miRNA表达变化，将一个上调的miRNA和三个下调的miRNA做比值，用受试者工作特征曲线来确定哪些miRNA表达比能具有预测价值。本实验研究结果表明miR－21／miR－199a－5p具有96%的灵敏度和100%的特异度。与单纯的miRNA表达变化相比，miRNA表达比具有更强大的预测能力，更小的误诊率和漏诊率。

［1］Garzon R，Calin GA，Croce CM.MicroRNAs in cancer［J］.AnnuRev Med，2009，60：167.

［2］He L，thomson JM，Hemann MT，et al.A microRNA polycistron as apotential human oncogene［J］.Nature，2005，435（7043）：828.

［3］Voorhoeve PM，le Sage C，Schrier M，et al.A genetic screen implicates miRNA－372and miRNA－373as oncogenes in testicular germ cell tumors［J］.Cell，2006，124（6）：1169.

［4］Johnson SM，Grosshans H，Shingara J，et al.Ras is regulated by the let－7microRNA family［J］.Cell，2005，120（5）：635.

［5］Kobayashi E，Hornicek FJ，Duan Z.MicroRNA Involvement in Osteosarcoma［J］.Sarcoma，2012，359.

［6］Sita－Lumsden A，Dart DA，Waxman J，et al.Circulating microRNAs as potential new biomarkers for prostate cancer［J］.Br J Cancer，2013，108（10）：1925.

［7］Nora Bandi，Erilt Vassella.MiR－15a／16are regulated in nonsmall cell lung cancer and control celll cycle progression in asynergistic and Rb dependent manner［J］.Mol Cancer，2011，10（1）：55.

［8］Selcuklu SD，Donoghue MT，Spillane C.miR－21as a key regulator of Oncogenic processes［J］.Biochem Soc Trans，2009，37（4）：918.

［9］Asaga S，Kuo C，Nguyen T，Terpenning M，Giuliano AE，Hoon DS.Direct serum assay for microRNA－21concentrations in early and advanced breast cancer［J］.Clin Chem 2011，57：84.

［10］Avissar M1，Christensen BC，Kelsey KT，et al.MicroRNA expression ratio is predictive of head and neck squamous cell carcinoma［J］.Clin Cancer Res，2009，15（8）：2850.

Studies on the roles of miRNA expression forecast in multiple myeloma

LIU Bo，LI Shi－long，YOU Jian－yu et al.（De－

partment of Orthopedics，China－Japan Union Hospital，Jilin University，Changchun130033，China）

ObjectiveWe sought to identify microRNA altered in multiple myelomaand determine that microRNA ratio is an predictive tool for multiple myeloma.MethodsThe plasma of MM patients and 30normal controls were choosed and cofirmed，Respectively.The miRNA expression profiles were examined with Illumina Bead Chips.The results were verified by qRT－PCR.The miRNA expression ratio was analysed by ROC curve，aiming to find the most predictive potential of combination－type markers.Results178miRNAs were found to be significantly deregulated in the plasma of 24MM patients and 30normal controls plasma samples.miR－21were significantly higher than in normal plasma sample，while miR－199a－5p，miR－16and miR－125a－5p showed low expression；Furthermore，the ratio of miR－21／miR－199a－5p showed a high sensitivity and specificity for disease predicition.ConclusionThese results indicate that miR－21／miR－199a－5p ratio could be used as diagnostic biomarker in multiple myeloma.

MicroRNA；multiple myeloma.；Biological Marker

R733.3

A

2014－02－23）

1007－4287（2015）02－0259－03

＊通讯作者