cks1siRNA对舌癌的细胞凋亡的影响研究

徐亚娟，高元奇，付丹阳，祁 婧，杨秋野，刘文书

（1.吉林省肿瘤医院，吉林长春130012；2.吉林大学基础医学院；3.吉林大学临床医学院；4.吉林大学第一医院）

cks1siRNA对舌癌的细胞凋亡的影响研究

徐亚娟1，高元奇2，付丹阳3，祁 婧3，杨秋野3，刘文书4＊

（1.吉林省肿瘤医院，吉林长春130012；2.吉林大学基础医学院；3.吉林大学临床医学院；4.吉林大学第一医院）

近年来研究表明，肿瘤的发生、发展是细胞周期调控因子的异常而导致细胞周期紊乱所致，因此，寻找有关的调控因子与肿瘤的发生、发展的关系进行研究，对肿瘤的治疗具有重要的意义［1］。Cks1是细胞周期蛋白依赖性激酶的亚基，它是高度保守的Sucl／cks家族成员，能与其他细胞周期蛋白激酶和磷酸化蛋白结合，参与细胞周期的调控，与肿瘤的发生、发展密切相关［2］。本文用RNA干扰抑制CKS1的表达，观察其对舌癌细胞的细胞周期和凋亡的影响，为其基因治疗舌癌提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

人舌癌细胞Tca8113购自北京博枫科生物科技有限公司；培养基采用DMEM（美国，Gibco公司）；10%胎牛血清（以色列）和双抗，合成Cks1siRNA：5’－UGGAGGAAUCUUGGCGUUCUUTT－3’（有意义链），5’－UUCUUCGAACGUGUCACGUTT－3（无关对照链）（上海GenePharma公司）。siRNA序列进行2＇Ome修饰（稳定化学结构）和5＇FAM修饰（绿色荧光）。GenePharma siRNAMateTM转染试剂盒。RAPI裂解液（上海碧云天生物技术有限公司）；BCA试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；内参抗体GAPDH抗体购自美国Abcame公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人舌癌细胞Tca8113采用含10%胎牛血清的DMEM培养基在5%CO2、37℃细胞培养箱中培养。细胞生长至90%汇合，0.25%胰酶（含1%EDTA）消化，含血清DMEM终止消化，吹打细胞成单细胞悬液，1∶4比例传代。倒置显微镜下观察细胞形态。取对数生长期的细胞用于以下试验。

1.2.2 Cks1siRNA转染 合成Cks1siRNA：5’－UGGAGGAAUCUUGGCGUUCUUTT－3’（有意义链），5’－UUCUUCGAACGUGUCACGUTT－3（无关对照链）siRNA序列进行2＇Ome修饰（稳定化学结构）和5＇FAM修饰（绿色荧光）。按GenePharma siRNA－MateTM转染试剂盒和siRNA－MateTM转染试剂盒操作。体外培养细胞至2.5×104个／mL，并提前一天将细胞接种在24孔板中，待细胞的汇合度在30%－50%采用siRNA－MateTM转染试剂盒将CKS1siRNA导入Tca8113细胞，37℃，CO2培养箱孵育。

1.2.3 western blot检测转染前后Tca8113细胞的Cks1蛋白表达水平 收集细胞，将细胞分为3组，每组分别为空白组、阴性对照组、siRNATca8113组，每组设3个复孔。空白组的Tca8113细胞用0.25%胰蛋白酶消化Tca8113细胞，制成单个细胞悬液，以每孔5×103个接种于96孔培养板，补足高糖DMEM培养液至100μl，在CO2孵育箱中37℃、5%CO2以及饱和湿度的条件下，培养24 h；阴性组（与人类基因组序列无同源性）和siRNA组Tca8113细胞先进行CKS1siRNA转染4h，CKS1－siRNA转染浓度为10UM。通过SDSPAGE和western blot对转染前后Tca8113细胞的Cks1蛋白表达水平进行检测。

1.2.4 转染前后Tca8113细胞周期及细胞凋亡的检测 细胞的培养如上准备，按操作说明书进行Annexin V－FITC和碘化丙啶染色后，采用流式细胞仪对转染前后Tca8113细胞的凋亡率及细胞周期的影响进行检测。检测细胞周期百分数、凋亡指数、增殖指数作为评估参数，每组细胞获得10个数值。

1.2.5 统计学方法 所有数据通过Excel电子表格输入计算机建立数据库进行整理，计算出各组各参数的均值及标准差（x—±s），作为主要描述性指标；方差分析各主要指标的差异进行比较。全部统计计算应用SAS软件包完成。

2 结果

2.1 Western blot检测siRNA转染后Tca8113细胞Cks1蛋白表达水平的影响

经Imagej软件分析图像灰度值，进行半定量分析，各组之间的比值差异2倍以上认定为有显著性差异。如图1、表1所示，siRNA转染后的Cks1蛋白水平显著下降，与对照和空白siRNA组比较均有显著性差异。

图1 Western blot检测siRNA对Tca8113细胞Cks1蛋白水平的影响

表1 CKS1的蛋白表达水平

2.2 siRNA转染对细胞凋亡的影响结果

见表2。与空白对照比较，阴性转染对照组无明显变化，转染组的凋亡细胞比例显著高于对照（P＜0.05）。

表2 流式检测siRNA转染前后Tca8113细胞的凋亡率的比较（%）

2.3 siRNA转染对细胞周期的影响结果

见表3。与空白对照比较，阴性转染对照组无明显变化，转染组G2期细胞比例显著增多（P＜0.05）。细胞周期阻滞于G2期。

表3 转染处理前后Tca8113细胞的细胞周期的比较（%）

3 讨论

Cks1是高度保守的细胞周期调节蛋白Suc1／Cks蛋白家族成员之一。目前已经有大量的研究表明Cks1在多种肿瘤的病理组织中（包括胃癌、乳腺癌和直肠癌等）高表达，并发挥着一定的生物学功能［3－5］。

Cks1siRNA在抑制多种肿瘤的表达中可能发挥重要作用。Wang等［6］运用RNA干扰技术证实了干扰Cks1基因能促进乳腺癌细胞凋亡。Tsai等［7］利用RNA小分子干扰实验对肺癌和上皮癌进行实验研究发现，肿瘤细胞停滞在G2／M期，并且肿瘤细胞出现了大量的凋亡。但对正常的细胞无明显的生长抑制和凋亡的作用，提出Cks1干扰可作为癌症基因治疗的靶点。本实验结果显示Cks1siRNA成功地干扰了Tca8113细胞中的cks1蛋白的表达。转染组的凋亡细胞比例显著高于空白组和阴性转染组对照组（P＜0.05），增加了细胞出现了凋亡。转染组G2期细胞比例显著增多，显示了转染Cks1siRNA引起细胞的G2／M阻滞，细胞能够复制DNA，但是不能完成有丝分裂，使得细胞无法完成复制，与凋亡检测结果吻合。与文献的报道相一致。Cks1siRNA抑制了Tca8113细胞阻滞于G2期，增加了细胞出现凋亡，研究结果为Cks1siRNA治疗舌癌的进一步的实验研究提供实验基础。

［1］Kratzat S，Nikolova V，Miething C，et al.Cks1is required for tumor cell proliferation but not sufficient to induce hematopoietic malig－nancies［J］.PLoS One，2012，7（5）：e37433.

［2］张秀梅，金 松，刘 曙，等.Cks1在老年肝细胞癌中的表达及临床意义［J］.中国肿瘤外科杂志，2013，5（4）：239.

［3］Masuda TA，Inoue H，Nishida K，et al.Cyclin－dependent kinase 1 gene expression is associated with poor prognosis in gastric carcinoma［J］.Clin Cancer Res，2003，9（15）：5693.

［4］Westbrook L，Manuvakhova M，Francis GK，et al.Cks1regulates cdk1rxpression：a novel role during mitotic en－try in breast cancer cells［J］.Cancer Res，2007，67（23）：11393.

［5］Shapira M，Ben－Izhak S，et al.The prognostic im－pact of the ubiquitin ligase subunits Skp2and Cks1in colorectal carcinoma［J］.Cancer，2005，103（7）：1336.

［6］Wang XC，Tian J，Tian L，et al.Role of Cks1amplification and overexpression in breast cancer［J］.Biochem Biophys Res Commun，2009，379：1107.

［7］Tsai YS，Chang HC，Chuang LY，et al.RNA Silencing of Cks1Induced G2／Mm Arrest and Apoptosis in Human Lung Cancer Cells［J］.IUBMB Lufe，2005，57：583.

2014－08－12）

1007－4287（2015）02－0202－02

吉林省发展和改革委员会资助（项目编号：JF2012C006－8）

＊通讯作者