紫檀芪对体外循环心肌缺血与再灌注损伤的保护作用
2015-06-05赵冬梅
吕 民,李 哲,赵冬梅
(吉林大学中日联谊医院心血管外科,吉林长春130033)
紫檀芪对体外循环心肌缺血与再灌注损伤的保护作用
吕 民,李 哲,赵冬梅*
(吉林大学中日联谊医院心血管外科,吉林长春130033)
目的研究紫檀芪在体外循环术中作为心脏冷停搏灌注液的添加剂使用,对抗体外循环术中心肌缺血、再灌注损伤的作用。方法采用2-3月龄的幼猪,体重10.4-11.5kg,30只,随机分为三组,每组10只。组①为对照组,常规体外循环;组②常规体外循环,心脏冷停搏液中添加紫檀芪;组③常规体外循环,在心脏停跳前15min,静脉输入N'-硝基-L-精氨酸甲酯盐酸盐(L-NAME),心脏冷停搏液中加入紫檀芪。测定三组动物血清肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)水平及心肌组织髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)活性,以及心肌组织肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平,心肌组织的磷酸化的丝裂原激活蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPK)P38的活性。计算心肌细胞线粒体平均比表面和面数密度。结果组①血清CK-MB、心肌MPO活性、心肌组织TNF-α水平、心肌组织的磷酸化P38MAPK的活性明显高于组②(P<0.01),与组③相近;线粒体形态计量分析,组①线粒体面数密度及比表面明显低于组②(P<0.01),组③略高于组①(p>0.05),明显低于组②(p<0.01)。结论紫檀芪在体外循环心内直视手术时作为心脏冷停搏液的添加剂使用,能减轻术中心肌炎症反应,保护细胞膜结构的完整性及稳定性,保护心肌超微结构,对减轻术中心肌损害有明确的治疗作用。
紫檀芪;缺血再灌注损伤;炎症反应
(Chin J Lab Diagn,2015,19:0187)
体外循环下心内直视手术中,心肌保护方法及策略,一直是临床心脏外科医生的重要课题。紫檀芪(3,5-二甲氧基-4'-羟基二苯乙烯)是一种天然存在的化合物,起初在蓝莓及紫檀木中发现[1,2]。紫檀芪结构类似于白藜芦醇,白藜芦醇在红酒中被发现,具有抗氧化,抗炎,抗肿瘤作用。因为紫檀芪具有两个甲基,这使其具有更高亲脂性,从而获得更高的生物利用度[35]。越来越多的证据显示,紫檀芪在对诸如神经、代谢、及血液疾病等多种人类疾病起着预防及治疗作用[6]。进一步实验性研究表明,紫檀芪具有抗多种恶性肿瘤的作用[7]。我们在幼猪体外循环模型中,应用紫檀芪作为心脏冷停搏灌注液的添加剂,观察心肌细胞超微结构,探讨紫檀芪对体外循环术中心肌缺血再灌注损伤的保护作用。
1 材料与方法
1.1 对象采用2-3月龄的杂种幼猪,体重10.4-11.5kg,30只,随机分为3组,每组10只,组间年龄、体重、心肌灌注量平均值差异无显著性(P>0.05)。
1.2 制剂药品心脏冷停搏液组成为:0.9%生理盐水500ml,10%氯化钾7.5ml,5%碳酸氢钠5 ml,25%硫酸镁4ml,10%葡萄糖酸钙10ml,2%利多卡因1.25ml。紫檀芪来自Sigma公司(美国);MPO及CK-MB检测试剂盒(南京生物工程研究所);TNF-αElisa试剂盒购自安迪生物科技公司(美国);L-NAME购自Sigma公司(美国)。
1.3 方法①按照我们前期实验的方法建立体外循环[8],转机5min后,阻断升主动脉,经主动脉根部经灌注针行心肌灌注,灌注心脏冷停搏液,每20 min重复灌注。升主动脉阻断后30min,开放升主动脉,停止体外循环。对照组:主动脉阻断时间30 min,心肌灌注量平均为480ml;Pte组:主动脉阻断时间30min,心肌灌注量平均为500ml,在心肌冷停搏液中加入100μmol/L紫檀芪;Pte+L-NAME组:主动脉阻断时间30min,心肌灌注量平均为495 ml,在心脏停跳前15min,L-NAME1mmol/L静脉输入,心肌冷停搏液中加入紫檀芪浓度100μmol/L。②取材及标本制备:于升主动脉开放后120 min,取静脉血10ml,离心出血清,然后保存于-20℃冰箱中。按CK-MB检测试剂盒操作,检测血清CK-MB活性;取右心耳组织,按照MPO检测试剂盒及TNF-αElisa试剂盒说明,检测心肌MPO及TNF-α水平;采用改良蛋白印迹法(Western blots)检测心肌磷酸化p38MAPK的活性;制作电镜观察标本,心肌超微结构观察,行线粒体形态学分析:每组电镜照片均应用自动图像分析系统进行线粒体形态计量分析[9],计算线粒体平均比表面和面数密度。
1.4 统计学方法本实验数据以均数±标准误表示,组间比较用方差分析,采用SPSS13.0统计软件处理。
2 结果
血清CK-MB水平(u/g)、MPO水平(u/g)、TNF-α水平(pg/mg)及心肌磷酸化p38MAPK活性(光密度值)的比较见表1。Pte组与对照组、Pte+L-NAME组相比血清CK-MB、MPO、TNF-α差异显著(P<0.01),对照组与Pte+L-NAME组比较差异无显著性(P>0.05)。心肌线粒体面数密度和比表面结果见表2,Pte组明显高于对照组和Pte+L-NAME组(P<0.01);而对照组与Pte+LNAME组无明显差异(P>0.05)。从以上实验数据我们知道体外循环过程中,导致血清CK-MB水平、心肌髓过氧化物酶水平MPO、心肌组织TNF-α水平、心肌磷酸化p38MAPK活性升高,在心肌冷停搏液中加入紫檀芪,可以抑制如上指标的升高,可以提高心肌线粒体面数密度和比表面。但紫檀芪的这种作用,可被L-NAME所拮抗。
表1 血清CK-MB、MPO、TNF-α水平及心肌磷酸化p38MAPK活性比较
表2 心肌线粒体面数密度和比表面
3 讨论
研究表明,炎症反应在心肌缺血再灌注损伤过程中,起着重要作用[10]。p38MAPK在炎症反应中具有重要意义,是参与炎症反应过程中调控多种基因表达的重要因子,磷酸化激活后,由胞质移入细胞核,调控多种基因转录,调节TNF-α、IL-6、IL-8等炎症细胞因子的表达。p38MAPK从炎性因子的产生、炎症细胞趋化、黏附、血管通透性增加等多个环节调控机体的炎症反应。
TNF-α主要由巨噬细胞分泌,是一种重要的炎症细胞因子,启动由缺血再灌注损伤诱导的炎症反应[11]。TNF-α诱导其他炎症细胞释放炎性介质,提高粘附因子的表达,促进中性粒细胞与血管内皮细胞的粘附。TNF-α具有负性肌力作用,抑制心肌收缩降低血压。TNF-α也能诱导心肌纤维凋亡,参加心室肌重构[12]。
如果抑制炎症细胞及其相关因子的活性,可减低缺血再灌注损伤[13,14]。髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)存在于中性粒细胞和单核细胞的嗜苯胺蓝颗粒中,是髓细胞的特异性标志。MPO的主要功能是产生次氯酸盐,并形成具有氧化能力的自由基在吞噬细胞内杀灭微生物。MPO不仅能直接杀灭吞噬细胞内的微生物,而且对机体调节炎症反应等方面发挥作用。
面数密度为单位参考系中的线粒体截面个数;比表面为某颗粒单位体积中的膜表面积。面数密度增大提示线粒体的数目增多,比表面增加说明线粒体单位体积内具有的表面积增大,有利于其进行物质交换。线粒体是细胞内产能单位,也是对缺氧最敏感的细胞器,线粒体的变化是评定心肌保护效果的重要指标[15]。内皮细胞源性的NO抑制中性粒细胞粘附及内向膜迁移[16],也能抑制TNF-α及其他炎症因子的表达。N'-硝基-L-精氨酸甲酯盐酸盐(LNAME),一种NO合成酶抑制剂。在本实验中,提前静脉给予L-NAME,可抵消紫檀芪的抗炎症,及心肌保护作用。
本实验表明,紫檀芪作为体外循环术中心肌灌注液的添加剂使用,能抑制磷酸化P38MAPK的活性,抑制TNF-α的表达,抑制MPO的表达水平,抑制了由缺血再灌注损伤所诱导的炎症反应,而达到了心肌保护的作用。从本实验可以推断出,紫檀芪抑制炎症反应是通过提高血管内皮细胞的NO的产生水平来实现的。在临床上,也为体外循环心肌保护提供了一个潜在的新的方法。
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Protective effects of pterostilbene on myocardial ischemic reperfusion injury in cardiopulrnonary bypass
LV Min,LI
Zhe,ZHAO Dong-mei.(Department of Cardiovascular surgery,China-Japan Union Hospital of Jilin University,Changchun130033,China)
ObjectiveTo study the effects of pterostilbene on alleviating myocardial ischemia and preventing the reperfusion injury when it was applied as the additive of the perfusion liquid in the process of cardiac surgery with cardiopulrnonary bypass(CPB).MethodsPiglets the age of 2-3months and weighs 10.4-11.5kg were randomly divided into three group.Control group,the cardiopulrnonary bypass alone.The pte group,pterostilbene was added to the perfusion liquid solution.The pte+L-NAME group,pterostilbene was added to the perfusion liquid solution,and LNAME.iv.15minutes prior to heart arrest.The activity of serum CK-MB,MPO,P38MAPK and levels of TNF-αwere determined in all kinds of groups.The changes of myocardial ultrastuctures were observed under eIectron microscope.ResultsThe level of CK-MB,MPO,TNF-α,P38MAPK was significantly increased in the control group than that in the Pte group(P<0.01),the control group was similar to The pte+L-NAME group.The result of mitochondria morphological measurement indicated that the mitochondrial face number density and specific surface were significantIy lower in the control group than those in the Pte group(P<0.01),the control group was similar to the pte+L-NAME group.Conclusionpterostilbene acted as the additive of the the cold stopping-pulse solution could attenuate inflammatory reaction and protect the myocardial membrane and the ultrastructure of myocardium and debate the damage in the cardioectomy.
Pterostilbene;reperfusion injury;inflammatory reaction
R654.1
:A
吕民(1969-),男,副教授,硕士研究生导师,主要从事心肺保护方面的研究。
2014-10-15)
1007-4287(2015)02-0187-03
吉林省产业技术研究与开发项目(2013C028-5)
*通讯作者