急性胰腺炎患者外周血单核细胞TLR9 mRNA的表达及意义*

曾玉剑，刘 霜,孙 亮,舒 若,施承民,

郭姝婧1,2,费昱达1,2,王昆华1,2,罗华友1,2△

(昆明医科大学第一附属医院:1.胃肠与疝外科;2.云南省消化病研究所；3.干疗科，昆明 650032)

论著·临床研究

急性胰腺炎患者外周血单核细胞TLR9 mRNA的表达及意义*

曾玉剑1,2，刘 霜3,孙 亮1,2,舒 若1,2,施承民1,2,

郭姝婧1,2,费昱达1,2,王昆华1,2,罗华友1,2△

(昆明医科大学第一附属医院:1.胃肠与疝外科;2.云南省消化病研究所；3.干疗科，昆明 650032)

目的 观察急性胰腺炎(AP)患者外周血单核细胞(PBMCs)Toll样受体9(TLR9)mRNA的表达情况。方法 收集52例发病24 h内的AP患者，采集第1、3、5天外周乙二胺四乙酸二钾(EDTAK2)抗凝静脉血，提取血浆低温冻存，用于成批检测胰弹性蛋白酶、促炎细胞因子、抗炎细胞因子等。同法采集其治愈后2～3个月的外周EDTAK2抗凝静脉血行上述检测，作为相应指标的基准水平值。分离外周血单核细胞用于随后成批作逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测TLR9 mRNA的表达变化规律。同法采集其治愈后3个月的外周EDTAK2抗凝静脉血行上述检测，作为相应指标的基准水平值。最终将成功采得治愈后3个月血液标本的前36例患者纳入最终研究。结果 AP患者的外周血PBMCs TLR9 mRNA相对含量高于其痊愈后3个月的基线水平(P<0.05)。AP患者的外周血PBMCs TLR9 mRNA相对含量表达改变与胰弹性蛋白酶、促炎细胞因子水平呈正相关，与抗炎细胞因子无相关性。结论 AP患者的外周血PBMCs TLR9 mRNA表达显著升高并与促炎细胞因子表达同步上调，提示AP的发生、发展可能通过TLR9介导。

Toll样受体9；急性胰腺炎;外周血单核细胞

急性坏死性胰腺炎(aute necrotizing pancreatitis,ANP)的治疗是一个医学难题。无论基础研究还是临床实践都尚未能取得根本性的突破：(1)ANP发病机理的研究尚无重大突破性发现，现有发病理论不足以解释急性胰腺炎(AP)的发生、发展；(2)ANP的发病率及病死率逐年上升，现美国每年AP患者约185 000例；其中25%发展成为ANP，后者的病死率高达50%。中国虽缺乏详尽的统计资料，但局部地区大宗病案报道也提示ANP的病死率呈上升趋势。AP发病始动环节不清、对ANP发生、发展的分子基础及发病机制认识不足，是AP治疗效果难如人意及ANP病死率居高不下的根本原因。Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是备受关注的一种哺乳动物细胞表面信号传导跨膜蛋白，在天然免疫识别病原体及介导炎性反应信号通路中有重要作用。TLR9 是TLRs家族成员中的重要一员，通过识别外源性的非甲基化CpG基序从而启动机体炎反应链。为探寻TLR9是否参与了人的AP，本研究检测了AP患者外周血单核细胞(PBMCs)的TLR9表达情况，以及其与常见炎症相关细胞因子的相关性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2010年3月至2010年8月本院急诊科观察室收治的52例发病24 h内的AP患者；诊断标准：采用人民卫生出版社第7版外科学教材。采集52例患者第1、3、5天外周乙二胺四乙酸二钾(EDTAK2)抗凝静脉血，提取血浆低温冻存，用于成批检测胰弹性蛋白酶、促炎细胞因子(TNF-α、IL-1)、抗炎细胞因子(IL-4)等。同法采集其治愈后3个月的外周EDTAK2抗凝静脉血行上述检测，作为相应指标的基准水平值。分离PBMCs用于随后成批作逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测TLR9 mRNA的表达变化规律。同法采集其治愈后3个月的外周EDTAK2抗凝静脉血行上述检测，作为相应指标的基准水平值。最终将成功采得治愈后3个月血液标本的36例患者纳入研究，其余16例排除。全部患者皆诊断明确，同时确认其3个月内未曾接受糖皮质激素、免疫抑制剂或具有免疫调节作用的药物治疗。患者年龄31～54岁，平均(47.1±1.9)岁。

1.2 试剂 人淋巴细胞分离液、Ficoll Taq DNA聚合酶(北京鼎国生物技术有限公司),DEPC(Sigma公司),Trizol试剂(Intrivogen公司),Rever Tra Ace逆转录酶(TOYOBO生物科技公司)。

1.3 方法

1.3.1 TLR9 mRNA的RT-PCR检测 (1)PBMCs的分离，抽取研究对象空腹静脉血15 mL,Ficoll法分离PBMCs。(2)PBMCs总RNA用Trizol按说明提取，用Trizol-三氯甲烷-异丙醇-乙醇法提取PBMCs总RNA。(3)逆转录引物，由TAKARA(中国大连)设计并合成：TLR9F,5′-TCC CTG CAT AGA GGT ACT TC-3′；TLR9R,5′-TCC AGC CAC TGA AGT TGT GA-3′；TaqMan探针：5′-FAM-CTA GAA GTC CCC CAA CTT CGA GTC-FAMRA-3′。取5 μg PBMCs总RNA逆转录为cDNA，再取5 μL cDNA进行扩增，扩增出的产物行1.5%琼脂糖电泳。用GAPDH作为内对照，其引物为:GAPDHF，5′-TGG GTG TGA ACC ACG AGA-A-3′；GAPDHR，5′-GGC ATG GAC TGT GGT-CAT GA-3′；Taq-Man 探针：5′-FAM-CTG CAC CAC CA ACT GCT TAG CTA MRA-3′。(4)逆转录反应合成cDNA，取RNA 1 μg加入oligo T 1 μL,5×Buffer 4 μL,10 mmol/L dNTP 2 μL,RNA酶抑制剂1 μL,DEPC水加至20 μL。反应条件：42 ℃ 20 min，99 ℃ 5 min,4 ℃ 5 min。(5)PCR检测TLR9、TLR7 mRNA表达相对含量，TLR9、GAPDH的引物序列设计应用在线引物设计软件Primer 3.0，由上海博亚生有限公司合成。扩增体系及反应条件:取2 μL cDNA,5 μL 10×PCR Buffer,2 μL dNTPs,上游、下游引物各2 μL、1 μL Taq酶,加灭菌双蒸水至总体积50 μL;94 ℃ 5 min预变性,94 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共30个循环,72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳,采用凝胶成像分析系统中进行图像分析。以GAPDH为内参照半定量,各样本表达强度=样本灰度值/GAPDH灰度值。

1.3.2 血清淀粉酶和脂肪酶的测定 抽取研究对象EDTAK2抗凝静脉血5 mL。淀粉酶和脂肪酶的测定在昆明医科大学第一附属医院生化中心的自动生化仪(Olympus AU5400,日本)上进行。

1.3.3 细胞因子检测 抽取研究对象EDTAK2抗凝静脉血5 mL,在常温下离心后收集上层血清保存于-80 ℃冰箱，用于细胞因子的检测。TNF-α、IL-1和 IL-4用ELISA试剂盒(R&D、Minneapolis、MN)来进行测定。最后用全自动定量绘图酶标仪(Bio-Rad、M550、Hercules、CA)来判断结果。

2 结果

2.1 血清淀粉酶和脂肪酶 血清淀粉酶和脂肪酶结果随AP的发展而呈现较为一致的变化；两酶在第1天组就都已经明显升高。淀粉酶(P<0.05)与脂肪酶都在第1天(P<0.05)达到峰值。但随后，淀粉酶呈逐级回落,而脂肪酶则在第3天快速回落,第5天时脂肪酶甚至降至近基线水平(P>0.05)，见表1。

表1 血清淀粉酶和脂肪酶检测结果

*:P<0.01，与对照组比较；-：此项无数据。

2.2 血清细胞因子检测结果 每个组的血清TNF-α、IL-1和 IL-4用ELISA进行检测(表2)。3种细胞因子表现为在不同时段的上调；TNF-α表现为缓慢的上调并在第5天组出现峰值；IL-1表现为快速上调，其后缓慢上升，峰值出现于第5天组；IL-4峰值出现于较早的第1天组，其后逐渐下降。

表2 血清细胞因子检测结果

*：P<0.05，与对照组比较；#：P<0.01，与对照组比较。

2.3 RT-PCR结果 自RNA逆转录而来的cDNA经凝胶电泳证实为目的片段大小(113 bp)。用Taqman探针对TLR9 mRNA表达进行定量分析；其结果揭示，在AP的前1周内，TLR9在PBMCs中呈现出明显的表达上调。TLR9 mRNA在第1天明显上调至对照组的7.89(22.98)倍(P<0.05)。随后，第3、5天组呈现缓慢上调表现(P<0.05)，于第5天组达峰值，分别为对照组的8.94(23.16)倍，9.51(23.25)倍。

3 讨论

AP是一种常见而严重的疾病，但其发病机制仍未能完全阐明；其中，重症胰腺炎病死率仍较高。作为一类新的跨膜蛋白，TLR家族的发现给AP发病机理探索提供了新的途径。TLR9在其家族中较晚被发现，通常被认为主要表达于B细胞、树突细胞等免疫细胞[1-4]。但是，最近有报道一些TLR家族成员也可以表达于某些上皮细胞[5]。此外，在一些肿瘤细胞上也有TLR9高表达的报道[6-11]。这些发现说明TLR9确实可以在一些免疫细胞甚至非免疫细胞上表达，并进一步提示在这些细胞上TLR9的作用可能并不是识别CpG基序。

本研究小组曾经对大鼠胰腺组织是否有TLR9表达进行过检测[1]。免疫组织化学提示TLR9主要表达在胰管，特别在胰管上皮。作者前期的实验也发现，TLR4在胰管上皮也有表达；这是否提示TLR9和TLR4存在着一致或协同的作用。胰管黏膜屏障(PDMB)[12]是一种被广泛认同的胰管自身的保护机制；通常认为它的保护作用既包括机械性隔离因素，也包括化学性机制。作为先天性免疫系统的一种重要受体，TLR9在胰管的表达揭示了一种可能，TLR9激活和其后细胞因子释放也许参与了PDMB的抗炎作用调节。据此，TLR9也可能为一个潜在的免疫调节点。免疫组织化学也揭示TLR9着色于胰腺的血管内皮系统。微循环损害是AP的早期病理改变之一；作者前期的实验也提示TLR4可能参与这一损害[13]。TLR9的免疫组织化学检测结合其实时RT-PCR结果揭示，TLR9可能涉及胰腺炎早期的血管微循环损害。

上述实验证实，大鼠胰腺是存在TLR9表达的。作者随后的研究亦证实，TLR9与大鼠实验性胰腺炎的发生、发展存在相关性。所以，本实验的目的在于希望将在动物实验的结论在人体中得到某种程度的验证。但由于伦理学的原因和客观上很难以直接获取胰腺炎时的人体胰腺组织，所以只能从较容易获取的其他组织的检测来间接证实或推测TLR9在人类AP时的作用和参与度。而TLR9在人体PBMCs的表达已经得到证实，鉴于此，本研究决定提取并检测AP患者外周血的单核细胞。

作者用外周静脉血行淀粉酶、脂肪酶检查作为判断AP的指标，这些指标提示典型AP改变。

3.1 早期AP患者PBMCs TLR9表达变化规律 为了探究TLR9与胰腺炎的关联性，实时RT-PCR被用于对TLR9 mRNA表达进行定量分析。实时RT-PCR结果证实TLR9 mRNA在人外周血单核细胞为低水平表达，但在AP早期，TLR9 mRNA表达即已经上调明显。TLR9 mRNA上调迅速，在第1天时已经上升7.89(22.98)倍(P<0.05)，其后逐渐上调并在第5天时达到峰值，约为对照组的9.51(23.25)倍(P<0.05)。这充分说明TLR9对于人类AP反应迅速，TLR9参与了AP的发展。随后1周时间内，TLR9表达并未出现明显得下调，而是维持在一个高水平上的缓慢上调。Lindau等[14]提出，CpG基序并不能特异性地诱导TLR9表达上调。结合本实验结果，可以间接地推测，人类AP能够诱导TLR9快速而强烈的表达上调。

3.2 早期AP患者外周血促炎细胞因子及抑炎细胞因子与TLR9的关系 TLR9的上调和血清中一些细胞因子的增加是密切相关的。以往的研究已经证实TLR9的激活可以诱导促炎症细胞因子，如IL-1、 IL-6、IL-10、IL-12 和 TNF-α等的大量释放[15]。作者对其中的两种，IL-1和 TNF-α进行了检测；它们在TLR9上调后的某一特定时段都表现为上调。这一结果间接支持作者关于TLR9参与了AP的推测。而且炎症时TLR9通路的具体作用靶点或最终的调节产物尚无定论，有理由相信上述促炎细胞因子是其可能的下游产物。同时，为进一步明确TLR9为促炎症性因素，作者还对抑制炎症的细胞因子IL-4进行了检测。结果表明，TLR9 mRNA表达在AP早期呈逐渐上调的表现的同时，作为具有抑制炎症作用的细胞因子IL-4的表达水平却在短暂上调之后维持于接近基线的水平，这说明TLR9在人类AP的发生、发展中可能确实是一种单纯的促炎性细胞介质。

3.3 AP病情轻重及预后与TLR9的相关性 通过分析本组AP患者的淀粉酶及脂肪酶走向与TLR9 mRNA表达水平，可以看出：在血清淀粉酶及脂肪酶浓度逐渐减低的时候TLR9 mRNA的表达水平是在继续上调的。结合前述的判断，TLR9在人类AP的发生、发展中是一种促炎性细胞介质，本研究可以推测，TLR9的表达水平与人类AP的病情严重程度和预后之间可能并没有一种必然的联系。

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Expression of TLR9 mRNA in peripheral blood mononuclear cells of patients with acute pancreatitis*

ZengYujian1,2,LiuShuang3,SunLiang1,2,ShuRuo1,2,ShiChengmin1,2,GuoShujing1,2,FeiYida1,2,WangKunhua1,2,LuoHuayou1,2 △

(1.DepartmentofGastrointestinalSurgery;2.YunnanResearchInstituteofDigestiveDiseases；3.DepartmentofCadreHealth,theFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming,Yunnan650032,China)

Objective To investigate the expression of TLR9 mRNA of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) in patients with acute pancreatitis.Methods Fifty two AP patients with the disease duration in 24 h were collected,peripheral EDTAK2coagulation vein blood were collected on the first,third and fifth day,then plasma were cryop reserved to detect pancreatic elastase,proinflammatory cytokines and anti-inflammatory cytokines.Then the peripheral EDTAK2coagulation vein blood two to three months after treatment were collected in the same method to undertake these tests,and act as the reference level value.Peripheral blood was collected from 36 acute pancreatitis patients.Three months later,peripheral blood was collected again from these 36 people as controls.PBMCs were isolated by Ficoll-Hypaque gradient centrifugation.RT-PCR was adopted to determine the relative content of the expression of TLR9 mRNA of the PBMCs.Results The relative content of expression of TLR9 mRNA were significantly up-regulated in the patients with acute pancreatitis,compared with that of controls (P<0.05).The up-regulated expression of TLR9 mRNA was related to expression of TNF-a and IL-1.Conclusion The up-regulated expression of TLR9 mRNA in acute pancreatitis patients indicates that infective factors might be mediated by TLR9.

Toll-like receptor 9;acute pancreatitis;peripheral blood mononuclear cells

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.05.015

云南省教育厅基金(2010Y170)。 作者简介：曾玉剑(1975-)，讲师，博士，主要从事胃肠肿瘤、疝和腹壁外科疾病、急性胰腺炎的临床及研究工作。△

,E-mail：huayoul@aliyun.com。

R657.5

A

1671-8348(2015)05-0623-03

2014-10-08

2014-12-10)