C57BL／6小鼠动脉粥样硬化中CD4＋CD25＋Treg和TGF-β的表达及其意义

陈越峰，陶琳琳，王庆航，朱 洁，周碧蓉

C57BL／6小鼠动脉粥样硬化中CD4＋CD25＋Treg和TGF-β的表达及其意义

陈越峰，陶琳琳，王庆航，朱 洁，周碧蓉

目的通过建立C57BL／6小鼠动脉粥样硬化模型探讨CD4＋CD25＋调节性T细胞（Treg）在动脉粥样硬化发病及治疗过程中的作用。方法24只雄性C57BL／6小鼠随机分为3组：正常对照组、动脉粥样硬化组、阿托伐他汀组。正常对照组给予基础饲料，其余组给予高脂饲料。高脂饲养4周后，阿托伐他汀组继续高脂饲养并加用阿托伐他汀干预，3组共观察16周。苏木精染色观察血管病变情况，流式细胞仪检测外周血CD4＋CD25＋Treg的表达情况，ELISA法检测外周血TGF-β浓度。结果①动脉粥样硬化组的动脉血管的内膜显著增生，CD4＋CD25＋Treg／CD4＋T细胞比例显著低于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。阿托伐他汀组的动脉血管较动脉粥样硬化组病变明显减轻。阿托伐他汀组的CD4＋CD25＋Treg／CD4＋T细胞比例较动脉粥样硬化组有显著提升（P＜0.01），与正常对照组差异无统计学意义。②动脉粥样硬化组TGF-β浓度较正常对照组明显降低（P＜0.01）。阿托伐他汀组的TGF-β的浓度显著高于动脉粥样硬化组（P＜0.01）；较正常对照组略低，差异无统计学意义。结论CD4＋CD25＋Treg及其分泌的TGF-β具有抑制动脉粥样硬化发展的作用，有望成为治疗动脉粥样硬化的新靶点。

调节性T细胞；动脉粥样硬化；流式细胞仪；阿托伐他汀

动脉粥样硬化是一种血管壁有大量脂质沉积的慢性炎症疾病，好发于大动脉并伴随有免疫细胞的浸润，如巨噬细胞、内皮细胞、平滑肌细胞和T淋巴细胞［1］。研究［2］证明免疫反应在动脉粥样硬化的发展中起着重要的作用，但是其相关的机制并不明确。CD4＋CD25＋调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）是一种具有抑制功能的T细胞亚群，Treg在红斑狼疮、白血病以及动脉粥样硬化的病理过程中发挥着重要的作用［3］。Treg数量的减少将会破坏机体自身免疫耐受调节［4］。转化生长因子β（transforming growth factor，TGF-β）是CD4＋CD25＋Treg主要产生的一种细胞因子［5］。Treg在动脉粥样硬化中的作用已经成为当前研究的热点。该研究通过建立C57BL／6小鼠模型探讨动脉粥样硬化发病过程中的CD4＋CD25＋Treg及相关因子TGF-β的表达及意义。

1 材料与方法

1.1 动物分组和模型建立24只SPF级雄性C57BL／6小鼠，实验初始体重为（25±5）g，由安徽医科大学动物中心提供。适应性饲养1周，随机分为3组：正常对照组，动脉粥样硬化组，阿托伐他汀组，每组8只，其中正常对照组给予基础饲料，动脉粥样硬化组和阿托伐他汀组给予高脂饲料（含81.85%基础饲料、0.15%胆固醇、18%猪油）；饲养4周后，阿托伐他汀组继续用高脂饲料并加用阿托伐他汀干预［阿托伐他汀溶于无菌生理盐水中，按2.5 mg／（kg·d）灌胃］［6］。各组小鼠均自由饮水。动物模型制备时间为16周。

1.2 主要药物和试剂阿托伐他汀片购自美国辉瑞公司；小鼠Treg流式试剂盒购自美国eBioscience公司；小鼠TGF-β试剂盒购自美国Becton Dickinson公司；小鼠外周血淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司；苏木精试剂盒购自北京海德生物公司；猪油为市售使用猪油。

1.3 组织标本留取16周饲养结束后，小鼠禁食12 h后处死，用水合氯醛1 mg／kg腹腔注射麻醉，固定于手术台上，剖开胸腔、腹腔、心包，先后用0.9%生理盐水及4%多聚甲醛从左心室逆行灌注固定主动脉后，自心脏根部至髂主动脉分叉处离断后取出，10%的中性福尔马林固定，常规脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋，主动脉根部开始，行连续石蜡切片，切片厚度为5 μm，每张切片取2个组织面，每隔10张取1张切片，每只小鼠取4张，行HE染色。

1.4 流式细胞仪检测小鼠内眦静脉采血0.3 ml，生理盐水稀释至1 ml，取一支15 ml离心管，加入1 ml分离液置于18～22℃条件下。将血液样本小心加于分离液液面上。18～22℃，1 500 r／min离心20 min。离心后，用吸管小心吸出分离液上层（包含白细胞的细胞层）0.5 cm以上的上清液，弃去。用吸管小心吸取分离液层、白细胞层及红细胞层置于另一新离心管内。所得离心管中加入10 ml细胞洗涤液混匀。18～22℃，1 200 r／min离心10 min。弃上清液，重复1次，细胞计数。每管加入细胞浓度为1×106／ml的淋巴细胞悬液，1号管加入0.125 μg CD4 FITC及0.06 μg CD25 PE抗体，各管加入相应的同型对照。加入预冷的流式细胞染色缓冲液500 μl洗涤细胞，1 000 r／min离心10min，沉淀细胞，弃上清液。用500 μl的流式细胞仪染色缓冲液重悬细胞，上机检测。

1.5 外周血TGF-β浓度小鼠内眦静脉采血0.3 ml，3 000 r／min离心后取得血清，使用ELISA法测定TGF-β细胞因子浓度，按照试剂盒说明书步骤。根据标准品的浓度以及相对应的光密度（optical density，OD）450值分析作出细胞因子的标准曲线图，根据酶标仪检测得到标本的吸光值（检测波长为450 nm），用标准曲线二次方程式计算TGF-β的浓度。

1.6 统计学处理采用SPSS 11.0软件进行分析，计量资料以±s表示。组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD检验。

2 结果

2.1 形态学改变小鼠主动脉根部组织学特征：实验16周后小鼠主动脉做切片及HE染色，正常对照组动脉血管壁外部和内壁的弹性板完整、清晰、内皮细胞的核心染色排列均匀（图1A）。其余各组动脉血管壁均有不同程度的变化。其中，动脉粥样硬化组血管壁不均匀增厚，血管壁有炎症细胞浸润，脂质沉积（图1B）。与动脉粥样硬化组比较，阿托伐他汀组的血管壁增厚，少量炎症细胞浸润，病变明显减轻（图1C）。

2.2 流式细胞仪检测外周血Treg及TGF-β的浓度动脉粥样硬化组的CD4＋CD25＋Treg／CD4＋T细胞的比例显著低于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。阿托伐他汀组的CD4＋CD25＋Treg／CD4＋T细胞的比例较动脉粥样硬化组有显著的提升，差异有统计学意义（P＜0.01）；与正常对照组比较差异无统计学意义。动脉粥样硬化组TGF-β浓度显著低于正常对照组，阿托伐他汀钙组的TGF-β的浓度显著高于动脉粥样硬化组，差异有统计学意义，见表1、图2。

表1 各组小鼠外周血CD4＋CD25＋Treg／CD4＋T细胞和TGF-β的浓度（n＝8，±s）

表1 各组小鼠外周血CD4＋CD25＋Treg／CD4＋T细胞和TGF-β的浓度（n＝8，±s）

与正常对照组比较：**P＜0.01；与动脉粥样硬化组比较：＃＃P＜0.01

项目正常对照组动脉粥样硬化组阿托伐他汀组F值CD4＋CD25＋Treg／CD4＋（%）10.25±1.196.45±1.24**9.75±1.17＃＃30.23 TGF-β浓度（ng／ml）18.32±3.838.55±3.26**16.93±3.67＃＃28.30

3 讨论

动脉粥样硬化病变形成过程中免疫反应贯穿始终。失衡的免疫内环境加速动脉粥样硬化的进展。Treg是一类CD4＋T细胞亚群，是免疫反应系统重要组成部分。Treg维持机体的免疫耐受，调节免疫系统平衡、控制自身免疫性疾病以及动脉粥样硬化的病理过程［7］。

本研究显示，C57BL／6小鼠在饲养16周后，动脉粥样硬化组的小鼠血管病变明显加重，CD4＋CD25＋Treg数量较正常对照组明显下降，差异有统计学意义，证明CD4＋CD25＋Treg可以有效抑制小鼠的动脉粥样硬化的病变。研究［8］证明输注CD25特异性抗体PC61可以显著增加斑块面积及炎症细胞浸润，证明CD4＋CD25＋Treg可抑制动脉粥样硬化的发展，本实验结果与上述研究一致。阿托伐他汀是一种3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂，对抑制动脉粥样硬化病变的发展进程和稳定斑块具有重要的作用，能够明显降低心脑血管的发生率和死亡率，在临床上已经得到验证［9］。本实验显示阿托伐他汀干预后，与动脉粥样硬化组比较，阿托伐他汀组小鼠的动脉血管病变明显减轻，CD4＋CD25＋Treg数量明显上升。研究［10］表明可能是因为阿托伐他汀能抑制树突状细胞的成熟，而不成熟的树突状细胞能够诱导Treg的形成，使Treg增多，从而抑制动脉粥样硬化病变的发展，进一步证明CD4＋CD25＋Treg在动脉粥样硬化中的作用。研究［11］证明体外实验中TGF-β可以促进Treg的成熟，协助Treg的存活和功能发挥。阻断TGF-β信号通路会活化效应T细胞，抑制Treg的成熟，减少Treg数量，大幅降低Treg的免疫抑制的能力［12］。本实验结果显示动脉粥样硬化组的TGF-β浓度较正常对照组显著降低，而经过阿托伐他汀的治疗后，动脉粥样硬化病变的程度明显减轻，显示TGF-β对动脉粥样发展起到抑制作用。本研究显示动脉粥样硬化发展和治疗的过程中CD4＋CD25＋Treg比例的变化与TGF-β的浓度变化呈一致性，推测CD4＋CD25＋Treg能够抑制动脉粥样硬化发展的作用机制可能是因为分泌TGF-β这样具有免疫抑制作用的细胞因子，可能TGF-β的水平不足导致诱导分化Treg的能力下降，从而致使Treg的数量减少，Treg数量不足，分泌TGF-β不足，机体对炎症反应抑制减弱，从而加重病变。经过阿托伐他汀干预后，Treg的数量上升，上调TGF-β浓度，促使动脉粥样硬化的病变减轻。因此，TGF-β对Treg的数量和功能都具有重要的作用，CD4＋CD25＋Treg及其分泌的TGF-β可以有效抑制动脉粥样硬化的发展。

综上所述，Treg参在动脉粥样硬化的形成和发展中发挥着重要作用。研究结果为应用Treg治疗动脉粥样硬化提供新的方向，有望成为治疗动脉粥样硬化的新靶点。

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Expression and significance of CD4＋CD25＋Treg cells and TGF-β in C57BL／6 mice model of atherosclerosis

Chen Yuefeng，Tao Linlin，Wang Qinghang，et al
（Dept of Cardiology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo investigate effects and mechanism on CD4＋CD25＋Treg in C57BL／6 mice model of atherosclerosis.MethodsTwenty-four male C57BL／6 mice were assigned to three groups：control group，atherosclerosis group and atorvastatin group.Control group was given normal diet，and the rest groups were given high fat diet. After 4 weeks of high fat diet，atorvastatin group was continued to keep high fat diet and given drugs.The mice were observed for 16 weeks.Vasculopathy was analyzed by hematoxylin-eosin staining.Expression of CD4＋CD25＋Treg in peripheral blood was analyzed by flow cytometry.Concentration of TGF-β was analyzed by ELISA.Results①Hyperplasia of intima was observed in AS group，and the percentage of CD4＋CD25＋Treg／CD4＋T cell was significantly lower than that of the control group（P＜0.01）.Atatorvastatin could significantly reduce the intimail thickness.The percentage of CD4＋CD25＋Treg／CD4＋T cell was significantly higher than that of AS group（P＜0.01）. Atorvastatin group and control group had no significant difference.②As group′s concentration of TGF-β was significantly lower than the control group（P＜0.01）.Atorvastatin group′s concentration of TGF-β was significantly higher than that of AS group（P＜0.01）.Atorvastatin group and control group had no significant difference.ConclusionOur date provides evidence to show CD4＋CD25＋Treg and autocrine secretion of TGF-β can inhibit the development of atherosclerosis，and they will be a new therapeutic target of atherosclerosis.

regulatory T cell；atherosclerosis；flow cytometry；atorvastatin

R 541.4

A

1000－1492（2015）07－0888－04

2015－02－09接收

安徽医科大学第一附属医院博士启动基金；安徽省高校省级自然科学研究重点项目（编号：KJ2011A158）

安徽医科大学第一附属医院心血管内科，合肥 230022作者简介：陈越峰，男，硕士研究生；周碧蓉，女，副教授，副主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail：zhoubirong1＠hotmail.com