脓毒症急性肾损伤的早期诊断及生大黄的疗效研究

韩芳　吴爱萍　孙仁华

[摘要] 目的 探讨脓毒症急性肾损伤的早期诊断指标及生大黄对其的保护作用。 方法 将60只大鼠按随机数字表法分为模型组（A）、治疗组（B）和对照组（C）三组，每组20只。模型组腹膜内注射脂多糖5 mg/kg诱导建立AKI模型，治疗组在腹膜内注射脂多糖即刻胃管内注入生大黄粉溶液，对照组腹膜内注射等量生理盐水。三组大鼠分别在处理前即刻（基础值，0 h），处理后1、6、24 h测定尿Netrin-1及尿KIM-1含量，同时采集血样测定肌酐含量。 结果 大鼠注射脂多糖6 h后，血清肌酐及尿KIM-1水平开始明显上升，注射后1 h尿Netrin-1即有明显上升，6 h达到峰值，24 h左右逐渐下降；生大黄治疗组大鼠各时间点血清肌酐、尿Netrin-1及尿KIM-1上升程度均较模型组明显降低（P<0.05）。 结论 尿Netrin-1对脓毒症急性肾损伤有早期诊断作用，生大黄可降低脓毒症急性肾损伤大鼠Scr、尿Netrin-1及尿KIM-1水平，对肾脏有保护作用。

[关键词] 急性肾损伤；脓毒症；生大黄；Netrin-1

[中图分类号] R692 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）16-0004-04

[Abstract] Objective To study early diagnostic index of septic acute kidney injury（AKI） and protective effect of rhubarb on septic AKI. Methods Sixty rats were randomly divided into the following 3 groups： model group （A）， treatment group （B） and control group （C）. Each group contains 20 rats. Rats from group A were received a intraperitoneal injection of lipopolysaccharide （LPS） at a dose of 5 mg/kg to induce AKI. Rats from group B were given rhubarb powder solution by oral administration immediately after LPS injection. Rats from group C were treated with the same volume of normal saline （NS） by intraperitoneal injection. Both serum level of creatinine （Scr） and urinary levels of Netrin-1 and KIM-1 of rats in 3 groups were detected in the different time points of treatment （0 h， 1 h， 6 h and 24 h）. Results The levels of KIM-1 and CR in rats treated with LPS were obviously increased at the time point of 6 h （P<0.05）. The urinary level of Netrin-1 began to increase at the time point of 1 h and reached the highest level at the time point of 6 h， then gradually decreased at the time point of 24 h after the injection of LPS. In group B， the levels of Scr， Netrin-1 and KIM-1 were significantly lower as compared with group A （P<0.05）. Conclusion The urinary level of Netrin-1 might has early diagnostic value in septic acute kidney injury. Rhubarb could protect the kidney of AKI model rats by decreasing the serum level of Scr， urinary levels of Netrin-1 and KIM-1.

[Key words] Acute kidney injury； Sepsis； Rhubarb； Netrin-1

脓毒症（sepsis）是一种由感染诱发的全身炎症反应综合征，可引起多器官损伤。在脓毒症人群中急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）发生并不少见，发生率随着脓毒症的严重度上升而增加，在中等程度、重症脓毒症和脓毒症休克患者中，AKI的发生率分别是19%、23%和51%，和其他原因相比，脓毒症所致的AKI血流动力学更不稳定，需要升压药与机械通气的患者比例较高，疾病严重度评分更高，最终导致死亡率也明显升高[1]。脓毒症AKI已成为医务工作者面临的重大医疗问题。近年来，随着对脓毒症和AKI的发病机制认识的深入，容量管理、内环境监控、器官支持的水平不断提高，虽然在脓毒症合并AKI治疗方面有所进展，但脓毒症AKI的病死率仍然居高不下，因此早期诊断及早期治疗是防治脓毒症AKI的最佳策略。本文从动物实验来探讨生大黄对脓毒症急性肾损伤的保护作用以探寻早期诊断急性肾损伤的可靠指标。

1 材料与方法

1.1实验材料

1.1.1 健康动物 60只健康、成年SD大鼠，雄性，体重（253±27）g，由浙江省医学科学院实验动物中心提供，常规饲养3 d后用于实验。

1.1.2 器材 Olympus AU5400全自动生化分析仪，美国bio-rad model 680酶标仪（美国bio-rad公司）。

1.1.3 试剂 大肠杆菌脂多糖（美国Sigma公司）；血清肌酐检测（Scr）试剂（日本Olympus公司）；Netrin-1酶联免疫吸附试剂盒及KIM-1酶联免疫吸附试剂盒（均由上海卡努生物科技有限公司提供）。

1.2 实验方法

1.2.1 实验设计 将60只大鼠按随机数字表法分为模型组（A）、治疗组（B）和对照组（C）三组，每组20只。模型组腹膜内注射脂多糖5 mg/kg诱导建立AKI模型，治疗组在腹膜内注射脂多糖5 mg/kg即刻胃管内注入生大黄粉溶液25 g/kg加温开水3 mL，对照组仅腹膜内注射等量生理盐水。

1.2.2 检测方法 三组大鼠分别在处理前即刻（0 h），及处理后1、6、24 h收集尿液（通过膀胱按摩法），用酶联免疫吸附法测定尿轴突导向因子-1（Netrin-1）及尿肾损伤分子-1（kidney injury molecule-1，KIM-1）含量（操作按试剂说明书进行），上述四个时间点同时采集血样用苦味酸法使用全自动生化分析仪测定血肌酐（Scr）含量。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示，三组间差异及不同时点比较采用方差分析，两组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠血清肌酐（Scr）的变化

A组大鼠注射脂多糖6 h后，Scr才明显上升（P<0.05），24 h更高，B组Scr上升时间与A组相仿，但升高程度较A组明显下降（P<0.05），C组未见明显变化见表1。

2.2大鼠尿Netrin-1的变化

A组大鼠尿Netrin-1水平在造模后1 h即有明显上升（P<0.05），6 h达到最高值，24 h开始逐渐下降，B组尿Netrin-1水平上升时间与A组相仿，但各点升高程度较A组明显下降（P<0.05），C组未间明显变化见表2。

2.3 大鼠尿KIM-1水平的变化

A组0 h、1 h KIM-1基础水平表达量无明显差异（P>0.05），6 h 开始上升明显（P<0.05），24 h时更高，此时上升水平近50倍，B组尿KIM-1水平上升时间与A组相仿，但各点升高程度较A组明显下降（P<0.05），C组未间明显变化见表3。

3 讨论

危重病患者中脓毒症发病率高，是引起多脏器功能障碍（MODS）和急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）的常见危险因素[1]。脓毒症极易并发急性肾损伤[2-9]，过去认为脓毒症AKI是由肾脏低灌注引起，但研究发现在肾脏血流正常甚至增加的情况下仍可能发生AKI，而炎性因子风暴、细胞凋亡亦可能参与了脓毒症AKI的发病过程。ICU中脓毒症可引起大约35%～50%的AKI[2]，这些患者液体复苏、营养支持和抗感染等治疗的难度明显增加，其病死率高达30%～60%。其症状不典型可导致诊断及治疗的延迟。脓毒症AKI的治疗包括控制原发感染、改善肾脏灌注、肾脏替代治疗等，但这些对脓毒症AKI晚期的患者疗效并不明显，如何早期识别、提高脓毒症诊断的敏感性，合理实施治疗策略，准确评估预后是目前面临的难题。所以发现敏感标记物来早期诊断脓毒症AKI，可以为治疗提供新的时间窗，从而降低脓毒症器官受累率，改善预后。因此对脓毒症AKI早期诊断和治疗的研究刻不容缓。

当脓毒症患者发生AKI 时，传统诊断指标主要依靠血肌酐的显著性升高，但是血肌酐在AKI早期不够敏感，其变化滞后于肾功能的减退，往往要在肾功能损失一半以上时才会出现明显变化，当患者血清肌酐升高及尿量明显减少时，其有效的治疗窗可能已经错过。所以血肌酐水平对肾功能的急性改变和肾损伤判断的敏感性和特异性均不佳，并不是一种理想的AKI标志物，不能检测出早期或潜在进行的AKI，因此无法用于早期诊断。本文资料也显示动物实验中造模后0、1 h血肌酐未能在早期就出现变化（P>0.05），6 h时才开始明显上升（P<0.05），提示血肌酐不能反映肾功能的早期损伤。

目前所研究的生物标志物[10-14]主要有尿生物标志物和血生物标志物两类，而尿生物标志物不仅无创、方便并且和血标志物一样能够预测急性肾损伤早期诊断和发展，前途远大[3]。轴突导向因子-1（Netrin-1）[4]是一种层粘连蛋白结构相似的分泌蛋白，在神经元的发育分化中占有重要地位，但近年来的研究发现它在非神经组织中如肾脏也有广泛高表达[13-16]，Netrin-1在急性肾损伤时其表达水平有动态变化[12]，因此已成为AKI生物标志物研究的热点之一[17]。有研究发现，AKI时Netrin-1短时间内强烈表达并分泌于尿液中[5]。本文探讨了脂多糖诱导建立AKI大鼠尿Netrin-1的排泄，模型组大鼠注射脂多糖后尿中Netrin-1的排泄在短时间内即有明显增加，1 h尿中Netrin-1水平即显著上升，在6 h达到最高峰（相对于基础值上升约17倍），然后缓慢下降，比Scr的增加早5 h。因此，上述结果提示相对Scr的变化时间而言，尿Netrin-1表达水平的检测将更有助于AKI的早期诊断。

肾损伤分子-1（kidney injury molecule-1，KIM-1）[10]是近年来发现的一种跨膜蛋白，在正常肾组织中表达很少，但在肾组织损伤后表达明显增高[15]，且与肾损伤的严重程度相关，尿中可检测到其可溶性片段[6]。本文动物实验显示所有大鼠注射脂多糖后尿内0 h、1 h KIM-1基础水平表达量均无明显差异（P>0.05），6 h时才可见KIM-1水平上升明显（P<0.05），24 h时达到峰值，此时模型组上升近50倍。其开始上升时间较Scr并未有明显提前。研究显示尿中KIM-1水平与Scr相比未见太大优势，与Netrin-1相比上升的时间较后者晚，提示尿中Netrin-1水平可能可以更早期地诊断AKI。

中药大黄具有泻下攻积、清热泻火、解毒、活血祛淤的功效，现代医学研究已经证明其具有退热、抗感染、消炎作用，能排除肠道及体内多种有害物质。动物实验[7]证实，急性肾损伤早期采用生大黄治疗能降低肾脏组织中TNF-α mRNA表达水平，减轻肾脏组织炎症程度，促进肾功能恢复。吴同辰等[8]的临床实验表明生大黄具有促进肠蠕动恢复、缓解中毒性肠麻痹、促进肠道细菌和内毒素的排泄、减少肠道菌群及毒素移位、稳定肠道微生态环境，从而尽快恢复肠内营养，保护胃肠道黏膜，改善患者营养状况；降低过度炎症反应、调节免疫，提高危重患者免疫力；还能改善微循环从而减轻脏器损伤并逐步恢复脏器功能。本文研究发现生大黄治疗组大鼠血肌酐、尿Netrin-1与尿KIM-1水平的升高程度均较模型组明显下降（P<0.05），提示急性肾损伤早期采用生大黄治疗，可以减轻肾脏损伤程度，防治急性肾功能衰竭，从而起到缓解病情、改善肾脏功能的作用。

本文实验研究表明，尿Netrin-1水平出现变化时间早，故可作为脓毒症AKI的早期诊断指标，与Scr及尿KIM-1相比可使AKI诊断明显提前，有利于我们早期对AKI进行干预。但脓毒症AKI的发病机制比较复杂，目前仍尚未完全明确，Netrin-1作为新的早期诊断AKI生物标志物目前研究不多，其机制有待进一步阐明，其临床应用效果也尚需进一步研究证实。目前尚无多中心研究证据支持仅凭某项单一的生物标志物可以进行早期快速的诊断及准确的预后判断，所以需要多种标志物联合检测期待达到较好效果。本实验还提示生大黄有希望成为治疗脓毒症AKI的有效药物。本研究仅为动物实验，虽已展现出令人振奋的前景，但亟待临床大样本的多中心随机对照研究，以进一步验证尿Netrin-1标志物对早期诊断及生大黄用于治疗脓毒症AKI的价值。

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（收稿日期：2015-01-21）