G6PD测定在新生儿黄疸中的应用

梁安玉

【摘要】 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏症是遗传性红细胞酶病中最常见的一种，呈全球性多民族分布。G6PD缺乏症主要由基因突变引起，为伴性不完全显性遗传，G6PD缺乏是新生儿发生早期病理性黄疸的危险因素。G6PD测定有助于早发现、采取有效的预防和治疗措施减少新生儿高疸红素血症及核黄疸，有利于新生儿健康成长。现对G6PD测定的方法、G6PD缺乏对新生儿黄疸的影响及预防治疗措施进行概述。

【关键词】 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶； 缺乏症； 新生儿黄疸； 应用

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.35.052

黄疸是新生儿时期的常见疾病，新生儿早期黄疸不易发现，当间接胆红素异常增高可并发核黄疸或脑组织损害，严重威胁新生儿生命和健康，对提高我国人口素质极为不利。G6PD缺乏是高间接胆红素血症的病因之一，早期明确黄疸的病因并及时干预对新生儿健康成长意义重大。现将G6PD测定在新生儿黄疸中的应用综述如下。

1 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）是一种存在于人体RBC内，参与葡萄糖磷酸戊糖旁路产生还原型辅酶Ⅱ（NADPH）的关键酶，对维护红细胞抗氧化系统的正常功能，保证红细胞膜骨架的稳定性有着极其重要的作用。G6PD缺乏症主要由基因突变引起，突变导致G6PD基因表达下降或G6PD酶结构改变，影响G6PD功能结构区的功能和二聚体的形成，致使G6PD酶活性降低。G6PD缺乏是伴性不完全显性遗传，其基因在X染色体长臂的2区8带上。按遗传规律：男性患儿及来源于母亲的女性患儿，母亲全部为G6PD缺乏的纯合子或杂合子，若女性患儿如为父源性，父亲为G6PD缺乏半合子。男性X染色体上的G6PD基因发生缺陷，酶活性就显著缺乏，故男性的酶活性只有两种状态：正常或显著缺乏；女性有两个X染色体，有两个G6PD基因，基因是否存在G6PD缺陷以及存在G6PD缺陷的红细胞数量的不同，使其酶活性受到不同程度的影响。故酶活性有三种状态：正常、中度缺乏和显著缺乏。男性发病率明显高于女性。

2 G6PD检测方法种类

G6PD检测方法很多，主要有以下方法。

2.1 高铁血红蛋白还原试验 红细胞中亚铁血红蛋白经亚硝酸盐作用变成高铁血红蛋白，正常红细胞的G6PD催化戊糖旁路使NADP变成NADPH，其脱出的氢经亚甲蓝试剂递氢作用使高铁血红蛋白还原成亚铁血红蛋白。当G6PD缺乏时，高铁血红蛋白还原率下降。该方法操作简便易行，实验稳定，成本低，检出率高，尤其是重度缺乏及正常人。该法无需特殊试剂，敏感度高，适用于基层进行筛查实验，但耗时长，假阳性高，特异性低。

2.2 荧光斑点试验 在G6PD和NADP+存在下，G6PD能使NADP+还原成NADPH，后者在紫外线照射下会发出荧光。荧光强弱反映酶活性强弱。对半合子和纯合子检出率最高，但对杂合子敏感性差，检出率不高。1995年谢彦晖等[1]经过改进，使特异性、敏感性和准确度都达到90%以上。该实验反应条件要求高，需专用仪器，因而在基层医院难于推广[2]。

2.3 硝基四氮唑蓝（NBT）比值法 即以NBT作为底物，间接测定G6PD活性和6PGD活性，计算G6PD/6PGD比值。受国际血液学标准化委员会推荐，本法操作简便、灵敏、结果比较可靠，对标本要求不严，试剂配制和设备简单。

2.4 NADPH定量比值法 血液中的G6PD催化G6P转化为6PG时，伴有NADP转化为NADPH，NADPH的量反映了G6PD的活性。通过直接测定NADPH的生成量来计算G6PD/6PGD比值。为世界卫生组织（WHO）推荐[3]，需要紫外分析仪或全自动生化分析仪，大大提高对女性杂合子的检出率，试剂用量少，出结果快。

2.5 G6PD活性检测 G6PD在NADP存在条件下催化葡萄糖-6-磷酸生成6-磷酸葡萄糖醛酸和NADPH。在340 nm处测定NADPH的生成速率，即可测定G6PD的活性。该方法省时、省力、简便、快捷，可减少试剂用量，降低检测成本，适用于大批量临床筛查，尤其适合于婚前、产前和新生儿筛查，是目前各个医院普遍使用的方法。G6PD活性的高低能反映其缺乏程度，但单测G6PD活性不能排除由其他原因引起的G6PD活性升高或降低，如：贫血、RBC增多症、溶血等。

2.6 G6PD基因检测 G6PD基因突变的检测最先用的是自然酶切点检测法。目前等位基因特异性扩增、等位基因寡核苷酸探针杂交等方法可检测已知突变；聚合酶链反应-单链构象多态性分析、变性梯度凝胶电泳等方法可检测未知突变。高分辨率熔解技术是近年来兴起的新检测方法，可同时检测出中国及东南亚主要的G1388A、G1376T、A95G基因突变。基因检测是通过检测基因突变，并结合生物信息学分析突变酶蛋白质的稳定性以判断新的突变是否会造成酶活性的下降[4]。基因检测能提高用传统方法检测酶活性正常的女性杂合子的检出率，以确诊试验。基因分析法是从基因水平诊断G6PD缺陷，但由于其成本较高，方法很复杂，需特殊设备，还无法常规使用。

3 G6PD缺乏与新生儿黄疸

G6PD缺乏症，呈世界性分布，据估计，全球大约有4亿人患此症，其发病率存在地域和人种差异性。我国的长江以南地区是高发区，尤其是广西、广东、云南、贵州、四川等省较高[5]。G6PD缺乏症分5型：蚕豆病、药物致溶贫、感染诱发溶血、新生儿高胆红素血症和遗传性非球形红细胞溶贫。G6PD缺乏是新生儿高胆红素血症的主要病因。2004年，美国儿科学会制定的≥35周新生儿高胆的诊疗方案中提出，G6PD缺乏为胎龄≥35周婴儿换血治疗的高危因素之一[6]。G6PD缺乏所致新生儿高胆红素血症患儿胎龄偏大（平均胎龄39.6周）[7]，有研究表明，胎龄29～32周的早产儿G6PD的活性要高于足月儿，推测可能是因为早产儿有更多的不成熟红细胞。

新生儿早期病理性黄疸血清中主要是间接胆红素增高，多数由溶血引起，少数为肝细胞处理胆红素障碍所致。胆红素是血红素分解代谢的主要产物，而血红蛋白、肌红蛋白等又是构成血红素的重要成分。胆红素主要来源于裂解的红细胞，约占80%。NADPH是谷胱甘肽还原酶的辅酶，由红细胞G6PD催化生成，还原型谷胱甘肽（GSH）能保持血红蛋白稳定性及红细胞膜完整性，G6PD缺乏者因食用某些药物或食物代谢产生自由基，或与氧和血红蛋白作用形成H2O2，GSH氧化成GSSG。GSH降低，Hb的巯基失去GSH的保护，被氧化变性成Heinz小体。红细胞膜失去巯基的保护而功能受损，导致溶血。G6PD缺乏者，红细胞抗氧化能力下降，易发生氧化损伤使膜骨架蛋白，特别是收缩蛋白发生聚集交联，破坏膜结构稳定性和变形性，红细胞变形性下降，使红细胞不能通过微血管被挤撞碎裂。因此G6PD缺乏可使新生儿胆红素来源增加，在体内累积出现黄疸。G6PD缺乏患儿高胆红素血症发病早、发病率高、程度重[8]，易引起胆红素脑病。黄疸常于生后2～3 d出现[9]，黄疸消退慢，一般为10 d左右，表明G6PD缺乏延缓了机体对胆红素的代谢。钟丹妮等[10]认为黄疸是新生儿G6PD缺乏症最主要的临床症状，G6PD缺乏症患儿有72.2%发生新生儿黄疸。目前许多对高胆红素血症新生儿G6PD筛查研究结果表明：G6PD缺乏存在一定比例，且男婴缺乏率高于女婴，说明G6PD缺乏是发生新生儿黄疸的原因之一。胆红素男女婴血清总胆红素均值分别高达（424.9±158.8）μmol/L、（396.1±131.3）μmol/L，出现黄疸后进展快，以间接胆红素增高为主，核黄疸可在血清胆红素较低水平时发生，研究显示总胆红素水平的高低与神经系统并不一致[11-14]。G6PD缺乏症的新生儿12%可发展为核黄疸[15]。G6PD活性缺乏程度越重的患儿高胆红素血症发生率越高[16]，发生胆红素脑病的几率越大。虽然除了胆红素水平外，胆红素脑病的发生还与以下因素有关：新生儿的状态、血脑屏障的功能状态、胆红素联结状态与游离胆红素水平等。但目前血清总胆红素和未结合胆红素的监测仍然是评估发生胆红素脑病风险的常用指标。但并不是酶活性越低，引起的黄疸程度越重、黄疸出现时间越早、黄疸消退时间越慢[11]。文献[17]报道，高胆红素组新生儿血清总胆红素水平与G6PD活性呈显著负相关，血清G6PD活性明显低于非高胆红素血症组，G6PD缺乏率明显高于非高胆红素组。目前酶缺陷程度与黄疸严重程度有关报道不多，也出现不同的报道，值得进一步深入研究。我国目前发现有28种G6PD基因变异型，以G1388A、G1376T、A95G三种G6PD基因突变类型为中国人群最常见[18]，都表现为酶活性降低，且为华人特有，这三种基因突变类型约占G6PD突变基因的90%。所以研究这三种基因突变类型对我国新生儿黄疸的影响意义重大。湖南长沙地区，新生儿黄疸严重程度从重至轻的次序为G1376T、A95G、G1388A，这三种G6PD基因突变类型酶活性差异并无统计学意义[9]。这与检测酶活性方法学不同，不同G6PD基因突变类型累及酶的功能部位不同，对蛋白功能的影响存在差异，G6PD活性及G6PD活性缺乏的RBC数量等众多因素影响新生儿出现不同的黄疸轻重程度。研究对象及地域、基因突变频率的差异，导致不同地区G1388A、G1376T、A95G基因突变类型引起新生儿黄疸的比例、持续时间、严重程度有不同的报道。

G6PD缺乏引起高胆的机制目前尚未完全清楚。傅雯萍等[19]报告，G6PD缺乏的新生儿，如同时存在肝脏葡萄糖醛转移酶1A1G71R突变或有机离子转运因子2A388GA基因突变，使足月新生儿高胆红素血症发生率增加。李梨平等[9]研究认为，G6PD缺乏症的患儿还原型辅酶Ⅱ不足，红细胞结构发生改变，功能出现异常，红细胞易破裂溶血使胆红素增高。苏珊珊等[20]认为，G6PD缺乏时血红蛋白和红细胞膜易发生氧化性损伤致溶血而使黄疸加重。G6PD缺乏发生高胆的诱发因素主要有，（1）宫内窘迫及产时窒息：胎儿或婴儿缺氧，产生大量的自由基，而G6PD缺乏的新生儿由于红细胞还原型辅酶Ⅱ（NADPH）生成能力不足，不能维持正常的抗氧化功能，致使红细胞大量破坏，导致高胆，而且分娩本身就是一个缺氧的过程；（2）感染：感染时吞噬细胞吞噬微生物产生过氧化物，促进血红蛋白变性，易发生溶血；（3）药物或某些化学制剂：如川连、磺胺吡啶等强氧化剂，也使红细胞破坏过多而发生高胆；（4）代谢障碍：低血糖、酸中毒；（5）其他因素：母亲乙肝病毒携带、ABO溶血病、妊娠期高血压疾病等[21]。但文献[22]表明，G6PD缺乏者不与已知的可导致溶血的化学物质或药物接触，仍可继续发生黄疸，而且在不少病例中找不到溶血的诱发因素，表明溶血并非G6PD缺陷症导致高胆红素血症的唯一机制。G6PD缺乏可能会减低肝细胞对胆红素的转化能力[23]。

4 G6PD测定与干预新生儿黄疸

由于G6PD缺乏症目前尚无根治方法，因此一旦发病就无法对症治疗。新生儿黄疸常规处理方法有光照、输注白蛋白或血浆、换血、药物治疗等，应该根据患儿的具体情况选择合适的治疗方法以提高治愈率。G6PD缺乏的患儿应对以上诱因进行预防和治疗，避免黄疸加重。蓝光照射可使未结合胆红素由Z型转化为异构E型，使其具有水溶性，经胆汁或从尿排出，从而降低血清胆红素。G6PD缺陷高胆红素血症新生儿对光疗致溶血效应比G6PD正常高胆新生儿更敏感。采用2次/d，4 h/次，间隔4～6 h的方法，间断光疗患儿比连续8 h/d光疗患儿不良反应发生率低，而疗效一致[24]。早期输注白蛋白能增加胆红素的结合位点，促进其代谢，从而减少游离的胆红素浓度。换血疗法能够移去有酶缺陷的红细胞，阻断溶血，还能换出大量未结合胆红素。药物治疗主要有肾上腺皮质激素类，如地塞米松能激活肝细胞酶系统。肝酶诱导剂常用苯巴比妥、尼可刹米。两者通过增强肝细胞微粒体活力来增加胆红素与葡萄糖醛酸结合，清除胆红素。此类药物对于肝酶活性不高的新生儿疗效显著。苯巴比妥、尼可刹米联用可减少不良反应。不同治疗方法其过程中可能会出现不良反应或并发症使患儿身体生长发育受到极大的影响，同时给患儿家庭、社会增加经济负担，因此防重于治。新生儿采用脐带血做G6PD活性检测，有利于早期诊断G6PD缺乏症。（1）对G6PD缺乏的患儿、哺乳母亲避免使用可能引起溶血的氧化性药物（WHO鉴定有20余种可诱发溶血的药物）或食物（黄连、珍珠粉及熊胆等），可防止溶血。（2）对缺乏的新生儿3 d内服用苯巴比妥5 mg，3次/d，（注3 d后始服，效果不佳）及肌肉注射维生素E，或生后1 h即给予鲁米那3～5 mg/kg静脉滴注，可降低新生儿高胆的发病率。维生素E为强抗氧化剂，它比红细胞更易被氧化，从而防止红细胞氧化损伤。鲁米那为肝酶诱导剂。（3）新生儿不穿戴含有樟脑丸气味的衣物，避免诱发溶血。（4）对其父母如一方有缺陷者，孕妇于妊娠36周开始服预防药（苯巴比妥、叶酸、维生素E和Bco等）可促使胎儿、新生儿血中游离胆红素与葡萄醛酸结合后从胆汁排出，从而可预防G6PD缺乏症的新生儿出现黄疸及其发展[25]。引起黄疸的病因较多，有时病因重叠，对G6PD缺乏患儿用经皮胆红素检测仪每天动态监测经皮胆红素浓度TCB，对TCB逐渐升高者，动态监测血清胆红素，防止脑损害的发生。脑干听觉诱发电位的监测是反映胆红素毒性对听觉中枢损害的灵敏指标。对G6PD缺乏患儿进行适时早期干预，能有效预防新生儿高胆红素血症的发生，测定血清神经元特异性烯醇化酶（NSE）、总胆红素与白蛋白比值可作为预判新生儿高胆红素血症发生脑损伤的指标[26]。

5 展望

新生儿黄疸与G6PD缺乏症有着密切的相关性。目前G6PD检测方法仍各有其局限性，因而开发和应用高度敏感、高度特异、重复性好，且廉价、简单而检出率高易于实现自动化和标准化的筛查及确认技术仍然是临床实践中的迫切需求，是实现有效干预及控制的技术支撑前提。迄今为止，世界范围内发现的G6PD基因突变已超过190种[27]，其中发现20多种G6PD基因变异型，引起溶血性黄疸。现已公认，G6PD基因12外显子、G6P、NADP结合位点及G6PD基因3末端为重要的功能区，但它们的空间结构仍不清楚，故探讨G6PD基因结构和功能的关系，基因突变后正常G6PD的三维结构改变对酶活性的影响从而对疾病的影响，仍为今后研究的重点。G6PD基因分子机制的深入研究，必定为揭示疾病的病理，提高临床诊断水平，指导临床干预与治疗提供更多新途径，而当前普及孕妇产前以及新生儿G6PD筛查，及早采取预防和治疗措施，更具现实意义。

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（收稿日期：2015-03-05） （本文编辑：欧丽）