六味地黄汤对肾间质纤维化大鼠肾组织中缺氧诱导因子—1α和Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的影响

唐群等

摘要：目的 探讨六味地黄汤抗肾间质纤维化的作用机制。方法 采用5/6肾切除法复制肾间质纤维化大鼠模型，随机分为假手术组、模型组、六味地黄汤组和依那普利组。六味地黄汤组予6.25 g/（kg·d）六味地黄汤灌胃，依那普利组予10 mg/（kg·d）马来酸依那普利悬浊液灌胃，假手术组和模型组予10 mL/（kg·d）蒸馏水灌胃，每日1次，连续12周。采用免疫组化法检测缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和Ⅰ、Ⅲ型胶原（CollⅠ、CollⅢ）在肾组织中的表达。结果 与假手术组比较，模型组肾组织中HIF-1α、CollⅠ、CollⅢ的表达均明显升高（P<0.05）；与模型组比较，六味地黄汤组和依那普利组肾组织中HIF-1α和CollⅠ、CollⅢ的表达均降低（P<0.05），且六味地黄汤组优于依那普利组（P<0.05）。结论 六味地黄汤可能通过下调HIF-1α和CollⅠ、CollⅢ的表达，改善肾组织慢性缺氧，发挥抗肾间质纤维化的作用。

关键词：慢性肾脏病；缺氧诱导因子-1α；Ⅰ型胶原；Ⅲ型胶原；六味地黄汤；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.019

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）04-0067-03

Effects of Liuwei Dihuang Decoction on Expressions of HIF-1α， CollⅠ， and CollⅢ in Renal Interstitial Fibrosis Rats TANG Qun， ZHANG Xi， LEI Jiu-shi， WU Hua， BU Lan-lan （Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China） Abstract：Objective To discuss the mechanism of Liuwei Dihuang Decoction against renal interstitial fibrosis. Methods The rat models of renal interstitial fibrosis were induced by 5/6 nephrectomy， and were randomly divided into sham-operation group， model group， Liuwei Dihuang Decoction group and enalapril group. Liuwei Dihuang Decoction group was given 6.25 g/（kg·d） of Liuwei Dihuang Decoction for gavage， enalapril group was given 10 mg/（kg·d） enalapril for gavage， sham-operation group and model group were given 10 mL/（kg·d） of distilled water for gavage， 1 time per day for 12 weeks. Expressions of HIF-1α， CollI， and CollIII in kidney tissue were detected by immunohistochemistry. Results Compared with the sham-operation group， the expressions of HIF-1α， CollI， and CollIII of renal tissue in the model group significantly increased （P<0.05）. Compared with the model group， Liuwei Dihuang Decoction group and enalapril group can inhibit the expressions of HIF-1α， CollI， and CollIII （P<0.05）， and Liuwei Dihuang Decoction group was better than enalapril group （P<0.05）. Conclusion The mechanism of Liuwei Dihuang Decoction against renal interstitial fibrosis may improve the renal tissue of chronic hypoxia to play the role of preventing renal interstitial fibrosis by decreasing the expressions of HIF-1α， CollI， and CollIII.

Key words：chronic kidney disease；hypoxia-inducible factor 1α；type I collagen；type III collagen；Liuwei Dihuang Decoction；rats

研究表明，缺氧誘导因子-1α（HIF-1α）在纤维

基金项目：湖南省科学技术厅科技计划（2013SK3085）；湖南省中医药科研计划项目（2013118）；湖南中医药大学重点学科建设项目-病理学与病理生理学（2012年）

化发展过程中起至关重要的作用[1]。慢性缺氧可诱发肾组织HIF-1α持续表达，后者上调一系列促纤维化相关靶基因加重肾损伤[2]，最终导致肾间质纤维化。Ⅰ、Ⅲ型胶原（CollⅠ、CollⅢ）的合成、分泌增多和/或降解减少是细胞外基质（ECM）积聚和肾间质纤维化的主要病理表现。本研究通过观察六味地黄汤对肾间质纤维化大鼠肾组织中HIF-1α及Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的影响，探讨其拮抗肾间质纤维化的作用机制。

1 实验材料

1.1 动物

清洁级健康雄性SD大鼠70只，鼠龄4～5周，体质量（180±20）g，湖南中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号SCXK（湘）2009-0001，饲养于湖南中医药大学SPF级动物房。

1.2 药物

六味地黄汤（熟地黄24 g、山药12 g、茯苓9 g、山萸肉12 g、泽泻9 g、牡丹皮9 g，购自湖南中医药大学第一附属医院药剂科），将饮片药材加5倍的自来水浸泡2 h，煮沸后文火煎煮30 min，过滤后收集煎液，剩余的药渣再加少量水煎煮，得二煎液。将两煎液混合，在水浴恒温器上浓缩至含原药材1 g/mL。马来酸依那普利片购自湖南千金湘江药业股份有限公司，批号20130522，每片10 mg加蒸馏水10 mL制成悬浊液，浓度为1 mg/mL。

1.3 主要试剂与仪器

一抗为兔抗大鼠HIF-1α、CollⅠ、CollⅢ多克隆抗体（美国Santa Cruz），兔二步法免疫组化检测试剂盒（PV-6001）、二抗为山羊抗兔（北京中杉金桥公司），DAB显色试剂盒（武汉博士德生物技术有限公司）。SHANDON FINESSE325型石蜡切片机（英国珊顿公司），BA410T生物显微镜（德国Motic公司），Motic Medical 6.0数码显微图像分析软件系统（北京麦克奥迪），微量加样器（北京吉尔森公司），CS-930双波长薄层扫描仪（日本岛津公司）。

2 实验方法

2.1 分组与造模

SD雄性大鼠适应性喂养1周后随机分为假手术组（10只），模型组（20只），六味地黄汤组（20只），依那普利组（20只）。模型组、六味地黄汤组、依那普利组均在无菌条件下进行5/6肾切除术，以10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉动物，常规消毒铺巾，从左腹部切口，打开腹腔，静脉夹夹住肾蒂后切除左肾上下极（切除2/3），以明胶海绵压迫止血，复位肾脏。1周后进行第2次手术，切除右侧肾脏。假手术组采取同样步骤，打开腹腔暴露肾脏后避免牵拉肾脏，但不切除肾脏。

2.2 给药

造模后第2日，六味地黄汤组予6.25 g/（kg·d）六味地黄汤灌胃，依那普利组予10 mg/（kg·d）马来酸依那普利悬浊液灌胃，假手术组和模型组均予10 mL/ （kg·d）蒸馏水灌胃，每日1次，连续12周。各组大鼠灌胃中途死亡者直接予以剔除。

2.3 标本收集

各组大鼠分别于造模第12周后予腹主动脉放血处死，肾组织用4%多聚甲醛固定。

2.4 免疫组织化学法检测

免疫组织化学PV二步法染色，一抗用兔抗大鼠HIF-1α、CollⅠ、CollⅢ抗体，二抗用相应山羊抗兔抗体（工作浓度按产品说明书配制为1∶100），染色呈棕褐色或棕黄色者为阳性染色。Olympus显微镜观察每张切片并随机选取5个视野，用麦克奥迪数码医学分析系统（Motic Med 6.0）进行图像分析。观察视野内免疫阳性细胞的平均灰度值，半定量法评估，测得组织细胞平均灰度值愈小，说明其蛋白水平愈高。

3 统计学方法

采用SPSS19.0统计软件进行分析。计量资料以—x±s表示，多组均数比较采用方差分析，组间两两比较采用LDS-t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 六味地黄汤对大鼠肾组织缺氧诱导因子-1α表达的影响

假手术组肾小管上皮细胞胞浆、核内微量表达；模型组肾小球、间质表达较弱，肾近曲小管、远曲小管上皮细胞胞浆、核内及管腔面均有大量棕褐色阳性表达；六味地黄汤组和依那普利组肾小球、间质无明显表达，肾近曲小管、远曲小管上皮细胞胞浆、胞核及管腔面有深棕黄色或棕黄色阳性表达。经半定量分析，与假手术组比较，模型组、六味地黄汤组和依那普利组HIF-1α表达增强、平均灰度值降低（P<0.05）；与模型组比较，六味地黄汤组和依那普利组HIF-1α表达减弱、平均灰度值升高（P<0.05），且六味地黄汤组优于依那普利组（P<0.05）。结果见图1、表1。

4.2 六味地黄汤对大鼠肾组织I、Ⅲ型胶原蛋白表达的影响

假手术组肾小球不表达，肾间质及肾小管胞浆、核内微量表達；模型组肾小球表达不明显，肾间质及肾近曲小管、远曲小管胞浆、核内及管腔面均有大量棕褐色阳性颗粒；六味地黄汤组和依那普利组肾小球表达均不明显，肾间质及肾近曲小管、远曲小管胞浆、胞核及管腔面有深棕黄色或棕黄色阳性颗粒。经半定量分析，与假手术组比较，模型组、六味地黄汤组和依那普利组CollⅠ、CollⅢ表达增强，平均灰度值降低（P<0.05）；与模型组比较，六味地黄汤组和依那普利组CollⅠ、CollⅢ表达减弱，平均灰度值升高（P<0.05），且六味地黄汤组优于依那普利组（P<0.05）。

5 讨论

Higgins等[3]研究发现，慢性缺氧可导致肾小管间质损伤，促进肾间质纤维化，而缺氧主要通过HIF-1及其氧敏感元件HIF-1α发挥作用[4]。Kimura等[5]通过应用5/6肾切除基因敲除小鼠模型发现，HIF-1α基因敲除小鼠的肾纤维化程度明显较野生型对照小鼠轻，同时在单侧输尿管梗阻模型中应用HIF-1α拮抗剂YC-1可明显减轻小鼠肾间质纤维化，从而推测抑制HIF-1α的表达可能是治疗肾脏纤维化的靶点。因此，Haase[6]提出缺氧激活的HIF-1α是导致肾间质纤维化的关键因子。正常状态下，体内纤溶酶原激活物及其抑制物（PAs/PAIs）和基质金属蛋白酶及其抑制物（MMPs/TIMPs）保持动态平衡。肾脏局部缺血、缺氧及炎症细胞浸润时，机体PAs/PAIs和MMPs/TIMPs表达失衡，致使ECM合成增多，降解减少，使大量ECM沉积于肾间质，引起ECM积聚，是导致肾间质纤维化的基本病理生理过程。胶原是ECM最重要的成分，CollⅠ、CollⅢ型是构成肾脏组织结构框架的主要胶原。

肾间质纤维化属中医“水肿”“虚劳”等范畴。虚、浊、瘀、毒为肾间质纤维化四大病理机制，其中虚为其根本。六味地黄丸由肾气丸衍化而来。由熟地黄、山萸肉、山药、牡丹皮、泽泻、茯苓组成。依那普利是血管紧张素转换酶抑制剂类药物，其不仅可通过降压、减少尿蛋白保护肾脏，还能通过减少肾小球ECM的蓄积，减少肾间质纤维化和肾小球硬化，延缓肾损害进展。我们前期研究显示，六味地黄汤可明显降低5/6肾切除大鼠血尿素氮、肌酐水平，减轻肾组织病理变化，减少间质胶原纤维增生[7]。六味地黄汤可下调5/6肾切除大鼠肾组织内PAI-1、TIMP-1的表达，从而延缓肾间质纤维化[8]。本研究结果显示，治疗组大鼠肾组织HIF-1α、CollⅠ、CollⅢ表达均明显低于模型组，且治疗效果六味地黄汤组优于依那普利组，提示其可能通过恢复PAs/PAIs和MMPs/TIMPs间的网络平衡，减少ECM中胶原蛋白的合成和/或增加其降解，从而达到减轻或抑制肾间质纤维化进程的目的。

参考文献：

[1] Pan SY， Chang YT， Lin SL. The role of hypoxia-inducible factors in renal fibrosis[J]. J Formos Med Assoc，2013，112（10）：587-588.

[2] Song YR， You SJ， Lee YM， et al. Activation of hypoxia-inducible factor attenuates renal injury in rat remnant kidney[J]. Nephrol Dial Transplant，2010，25（1）：77-85.

[3] Higgins DF， Kimura K， Iwano M， et al. Hypoxia-inducible factor signaling in the development of tissue fibrosis[J]. Cell Cycle， 2008，7（9）：1128-1132.

[4] Takiyama Y， Harumi T， Watanabe J， et al. Tubular injury in a rat model of type 2 diabetes is prevented by metformin：a possible role of HIF-1α expression and oxygen metabolism[J]. Diabetes， 2011，60（3）：981-992.

[5] Kimura K， Iwano M， Higgins DF， et al. Stable expression of HIF-1alpha in tubular epithelial cells promotes interstitial fibrosis[J]. Am J Physiol Renal Physiol，2008，295（4）：F1023-1029.

[6] Haase VH. Pathophysiological consequences of HIF activation：HIF as a modulator of fibrosis[J]. Ann N Y Acad Sci，2009，1177：57-65.

[7] 唐群，何澤云，徐文峰，等.六味地黄汤对5/6肾切除大鼠肾组织中细胞外基质的影响[J].湖南中医药大学学报，2012，32（11）：19-23.

[8] 唐群，何泽云，徐文峰，等.六味地黄丸对5/6肾切除大鼠肾组织中HIF-1α、PAI-1和TIMP-1表达的影响[J].中国中西医结合肾病杂志， 2012，13（9）：777-780.

（收稿日期：2014-09-27；编辑：华强）