蒙药暖宫七味丸微生物限度检查方法的验证

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【摘 要】 目的：应用验证试验，为暖宫七味丸制定微生物限度检查法。方法：采用药典规定的常规法和培养基稀释法，低速离心+薄膜过滤法测定该药品对5株验证菌的回收率，同时验证控制菌的检验方法。结果：5株人工污染菌的回收率均达到70%以上，符合验证要求。结论：经验证的方法有效去除了暖宫七味丸的抑菌成分，可用于该药品的质量控制。

【关键词】 暖宫七味丸；微生物限度检查；验证试验

【中图分类号】R29 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2015）11-0003-02

暖宫七味丸是收载于《卫生部药品标准》蒙药分册的口服丸剂。具有调经养血，暖宫，驱寒止痛之功效[1]。作用效果显著，未见毒副作用，是一种临床常用药。由于暖宫七味丸含有多种抑菌成分，如果仅采用常规的微生物限度检查方法，则不能反映出样品被微生物污染的情况。为此须选择合适的方法去除其抑菌成分，并对方法进行验证。本文依照微生物限度检查法的现行标准（《中国药典》2010年版一部）的相关规定[2]，建立了暖宫七味丸的微生物限度检查法；验证结果证明检验方法简便易行，准确可靠，为同类药物的微生物限度检查，提供了科学的试验依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

1.2 供试品 暖宫七味丸 新疆巴州第二人民医院提供。

1.3 培养基

1.4 试验用菌株

以上菌株均为第三代，来自中国食品药品检定检验院。

2 方法与结果

2.1 菌液制备分 别取枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌（sau）、大肠埃希菌（ECO）标准菌株各适量，转种于10ml灭菌后的营养肉汤中，于恒温（37℃）下培养18～24h；取白色念珠菌（cal）适量，转种于改良马丁培养基中，在25℃下恒温培养24～48h。分别移取1ml上述培养物，分别置于盛有加9ml的 0.9%无菌生理盐水溶液的试管中，十倍稀释使约为10-5～10-7（50～100cfu/ml）的菌悬液[2]。

将黑曲霉转移在改良马丁琼脂培养基上，25～28℃培养7d，用5ml 0.9%无菌生理盐水溶液洗脱孢子，之后移取1ml孢子液加入9ml 0.9%无菌生理盐水溶液中，十倍稀释使约为10-4～10-6（50～100cfu/ml）的孢子悬液[2]。

2.2 供试液制备取 样品10g，置锥形瓶中，加无菌NaCl-蛋白胨缓冲液（pH7.0）至100ml，4000rpm/min振摇5min，使充分溶解分散均匀，便可（1∶10）。

2.3 细菌、霉菌及酵母菌检查方法的验证[2]

2.3.1 试验组

2.3.1.1 平皿法 取“2.2”项下的供试液1ml，及“2.1”项下的5种验证用菌液各1ml，分别注入平皿中，快速倒入45℃完全溶化的相应培养基20ml，为减少误差每株菌平行制备2个平皿，待冷凝后，置所需温度下倒扣培养至规定的时间，观察计数。（结果见表1）

2.3.1.2 培养基稀释法 取供试液（10-1）1ml，等量分注5个平皿（0.2ml/皿），同时加入枯草芽孢杆菌50～100cfu，于所需温度下倒扣培养至规定的时间，观察计数。（结果见表3）

2.3.1.3 低速离心+薄膜过滤法 取供试液（1∶10）10ml，置无菌离心管中，以500r/min离心10分钟，分取上清液补加无菌NaCl-蛋白胨缓冲液（pH7.0）至10ml；过滤前用适量的稀释液湿润滤膜，之后将上述供试液10ml，用无菌NaCl-蛋白胨缓冲液（pH7.0）100ml稀释后薄膜过滤，以无菌NaCl-蛋白胨缓冲液（pH7.0）冲洗滤膜，共4次，每次100ml，将1ml枯草芽孢杆菌倒入最后1次的冲洗液里，混匀，过滤，取出滤膜，将菌面朝上，贴在预先制备好的相应培养基平板上培养，观察计数。（结果见表3）

2.3.2 菌液组 除了不加入供试液之外，其余按实验组的方法测定所加入的试验菌数。

2.3.3 供试品对照组 不加试验菌之外，其余方法同试验组，测定供试品本底菌数。

2.3.4 稀释剂对照组 将无菌NaCl-蛋白胨缓冲液（pH7.0）10ml于离心管中，加枯草芽孢杆菌1ml，其余操作同低速离心+薄膜过滤法。

2.4控制菌检查方法的验证

2.4.1 大肠埃希菌 量取“2.2”项下的供试液（10-1）10ml，转种于100ml的BL中，作为供试品组。另分别量取100ml的BL2瓶，每瓶中加入供试液（10-1）各10ml，其中1瓶中加入1ml ，81cfu/ml大肠埃希菌，为试验组；另1瓶中加入金黄色葡萄球菌88cfu/ml，为阴性菌对照组。3个组均置于37℃下恒温培养24h，观察培养基澄清度的变化；之后分别取浑浊管中的增菌培养物0.2ml做荧光反应与靛基质试验[2]。（结果见表4）

2.4.2 大肠菌群 取“2.2”项下10-1的供试液1ml，用0.9%无菌生理盐水稀释制成10-2和10-3的供试液。取10ml的乳糖胆盐发酵培养基3管，分别接入10-1、10-2、10-3的供试液各1ml，之后每管加入1ml

81cfu/ml大肠埃希菌为试验组。另取10ml的乳糖胆盐发酵培养基3管，同试验组的方法操作，其中加金黄色葡萄球菌（88cfu/ml）为阴性菌对照组；每管于恒温（37℃）下培养24h，观察结果[2]。（结果见表5）

3 讨论

3.1 微生物限度检查法为药物安全性检测的必检项目之一。暖宫七味丸是由7种蒙药材白豆蔻、天门冬、手掌参、沉香、肉豆蔻、黄精、丁香组成的口服丸剂，其中任一成分均有可能有不同程度的抑菌作用。根据其给药途径及处方分析，必须选用适当的方法处理供试品，以去除抑菌作用才能进行微生物限度检查，否则无法准确检出供试品中污染的微生物。

3.2 从表1结果可以看出，通过平皿法验证可知，暖宫七味丸对白色念珠菌、黑曲霉、大肠埃希菌及金黄色葡萄球菌没有抗菌作用或抗菌作用很弱，回收率在79%～100%之间，试验结果得到令人满意的效果（规定大于70%），为此平皿法可用于该药品的霉菌及酵母菌数检查。从表1还可以看出，暖宫七味丸对枯草芽孢杆菌非常敏感，完全被抑制，回收率仅为0；说明该药品对细菌的生长繁殖有较强的抑制作用，不能采用平皿法测定细菌数；必须改用其它的方法消除对细菌的抑制作用；于是本试验改用了培养基稀释法和低速离心+薄膜过滤法；表3结果显示，每皿0.2ml，消除抑菌成分仍达不到满意的效果，回收率低于70%。为了得到准确、可靠的结果，细菌数的测定方法采用了低速离心+薄膜过滤法，结果基本排除了抑菌活性成分，回收率达到70%以上；由此可见，低速离心加薄膜过滤法用于暖宫七味丸的细菌数检查，结果比较可靠。

3.3 本品含原药材粉末，按规定须检验大肠埃希菌及大肠菌群。由表4、5可以看出，在控制菌的验证中，试验组判断为阳性，结果检出控制菌（大肠埃希菌）；阴性菌对照组实验结果为阴性，金黄色葡萄球菌未被检出；故控制菌（大肠埃希菌、大肠菌群）用常规方法检验。

依据方法验证试验，暖宫七味丸的微生物限度检查可采用低速离心加薄膜过滤法检验细菌数；霉菌及酵母菌数选用平皿法检验，控制菌检验则选用常规法即可达到效果。

参考文献

[1]卫生部药典委员会.《卫生部药品标准》蒙药分册[S].1998：192

[2]国家药典委员会.《中国药典》[S].一部.2010：附录79-88.