山萸肉不同仓储时间与5—羟甲基糠醛含量的相关性研究

于莉等

摘要：目的 针对山萸肉因仓储时间长而引起色泽改变的现象，研究山萸肉仓储时间与5-羟甲基糠醛（5-HMF）含量的相关性。方法 收集仓储0、1、2、3、4年的山萸肉，采用高效液相色谱法，测定5-HMF含量。结果 建立了山萸肉中5-HMF的含量测定方法，仓储0、1、2、3、4年的山萸肉色泽由红色、黯红色、红褐色到褐色，5-HMF的含量从未检测出上升到0.292 8%；色泽为黑色的酒萸肉中5-HMF含量为0.954 4%～1.837%。结论 山萸肉色泽的加深与5-HMF的生成具有相关性。随着仓储时间的延长，山萸肉的色泽逐渐加深，5-HMF的含量显著升高。建议山萸肉的仓储期为1年。

关键词：山萸肉；5-羟甲基糠醛；色泽；仓储；高效液相色谱法；麦拉德反应

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）06-0095-04

山茱萸为山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb.et Zucc.的干燥成熟果肉，秋末冬初果皮变红时采收果实，用文火烘或置沸水中略烫后，及时除去果核，干燥而得。山茱萸经除去杂质和残留果核后统称山萸肉，山萸肉经酒炖法或酒蒸法炖或蒸至酒吸尽为酒萸肉[1]。新鲜的山萸肉呈红色，在常温仓库中随放置时间的延长，色泽会逐渐加深，可从红色变为黯红色、红褐色至褐色，酒萸肉则为黑色。

5-羟甲基糠醛（5-HMF）是从山茱萸炮制品中分离获得的活性成分，为补肝益肾的物质基础之一[2]。研究表明，5-HMF是糖类成分与蛋白质或氨基酸在一定温度、湿度条件下，发生麦拉德（Maillard）反应而生成的主要产物之一[3-4]。伴随的主要现象是食品和中药材色泽由浅到深[5]。随着中药材色泽的逐渐加深，5-HMF含量快速升高，这种现象往往更多出现在加热过程中[6]。目前，包括5-HMF在内的Maillard反应产物的药理和毒理作用存在较多争议[7]。《中华人民共和国药典》对蜂蜜中的5-HMF进行了含量限度规定，也有学者对牛膝提出了5-HMF的限量建议[8]。本研究通过对仓储0、1、2、3、4年的山萸肉样品中5-HMF含量进行测定，探讨山萸肉色泽变化与5-HMF含量的关系，为山萸肉的仓储时间提供依据。

1 仪器与试药

Shimadzu LC-20AT型高效液相色谱仪（日本岛津公司），KQ-100E超声波清洗器（100 W，40 kHz，昆山市超声仪器有限公司），Sartorius BP211D型电子天平（感量0.000 1 g，赛多利斯科学仪器有限公司），XS105 DualRange型电子分析天平（感量0.000 01 g，Mettler Toledo仪器系统有限公司），FW100高速万能粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）。

5-HMF对照品（纯度≥99%，批号BCBF6127V，美国Sigma-Aldrich公司），甲醇为色谱纯（德国Merck公司），水为娃哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯。山茱萸样品经中国中医科学院中药研究所巢志茂研究员鉴定为山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb.et Zucc.的干燥成熟果肉，样品来源见表1。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Cosmosil 5 C18-MS-Ⅱ（4.6 mm×250 mm， 5 μm），流动相为甲醇-水（15∶85，V/V），检测波长284 nm，柱温35 ℃，流速1.0 mL/min，进样量10 μL。

2.2 对照品储备溶液的制备

精密称取5-HMF对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0.233 4 mg的对照品储备溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取山茱萸样品，粉碎，取粉末0.2 g，精密称定，置50 mL具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇（V/V）50 mL，密塞，称定质量，超声处理50 min，放至室温，再次称定质量，用80%甲醇补足减失的质量，摇匀，0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。HPLC测定结果见图1。

2.4 线性关系考察

精密吸取5-HMF对照品储备溶液，配制成0.00002112、0.0001056、0.000528、0.00264、0.0132、0.0264、0.0528、0.0792、0.1056 mg/mL的溶液，依次分别进样10 μL，按上述色谱条件测定峰面积。以峰面积为纵坐标，进样量（μg）为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=7735907X-1060（r2=1.000 0），5-HMF在0.0002112～1.056 μg范围内与峰面积线性关系良好。

2.5 精密度试验

精密吸取对照品溶液（0.116 7 mg/mL）10 μL，连续进样6次，测定5-HMF峰面积值，计算RSD=0.28% （n=6），表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液（4号样品），室温放置，分别在0、2、4、8、12、24 h进样分析，测定5-HMF峰面积值，计算RSD=1.83%（n=6），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验

精密称取同一供试品（4号样品）粉末6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别进行测定，测得5-HMF平均含量为9.860 mg/g，RSD=1.94%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

精密称取同一供试品（4号样品）粉末6份，每份约0.1 g，精密称定，分别精密加入5-HMF对照品储备溶液4.5 mL，按“2.3”项下方法处理，测定5-HMF含量，计算平均回收率为102.17%，RSD=2.15%，见表2。

2.9 检测限及定量限

在上述条件下，将5-HMF对照品储备溶液逐级稀释并测定，确定检测限（S/N=3）为2.918×10-4 ng，定量限（S/N=10）为9.725×10-4 ng。

2.10 样品含量测定

取山茱萸样品，每批平行2份，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，将峰面积代入回归方程中计算5-HMF含量（平均值），结果见表3。可见，0、1年常温贮存后，样品中不含5-HMF，但随着仓储时间延长到2、3、4年，样品色泽逐渐加深，伴随5-HMF含量显著升高。

3 讨论

由于Maillard反应在加热条件下更容易发生，在考察提取方法时，应尽量回避加热处理。因此，本研究采用了超声提取法，而不采用水浴回流提取法[9-10]。

本试验分别考察了甲醇（80%、50%）、乙醇（100%、80%）的超声提取效果，结果表明，80%甲醇提取时， 5-HMF峰面积最大，且干扰较少。同时，对超声时间（20、30、40、50、60 min）进行了考察，结果随着超声时间的延长，5-HMF峰面积逐渐增大，当超声50 min时，5-HMF的峰面积增加不明显。故采用80%甲醇超声提取50 min。

在收集的18份山茱萸样品中，4份为酒萸肉，酒萸肉中5-HMF含量显著高于所有山萸肉样品，最高含量为1.837%。该结果与酒制加热过程中发生Maillard反应有直接的相关性[6]。

在收集的14份山萸肉样品中，当年秋末收获同年11月份测定的0年样品有2份，仓储1年的样品有6份，仓储2、3、4年的样品均为2份。从含量测定结果可以看出，未经仓储的0年样品和仓储1年的样品均未检测到5-HMF，而仓储2年以上的山萸肉样品中均检测到了5-HMF，且随着仓储时间的延长，5-HMF的含量逐渐升高。因此，我们建议山萸肉的仓储时间为1年。这与山茱萸中马钱苷的含量从第0年到第5年逐渐下降[11]，但在第1年内稳定，因而确定储存期为1年的结论[12]相符。另外，该现象也可阐释同为山萸肉样品，既有未检测出5-HMF者[13]，也有含量为0.06%～0.24%[14]、0.009%～0.011%[15]的报道，其原因可能在于仓储时间不同。

本研究结果显示，仓储0、1年的山萸肉均为红色，未能检测出5-HMF，而仓储了2、3、4年的山萸肉色泽依次加深为黯红色、红褐色、褐色，5-HMF含量逐渐升高，差异非常明显，色泽为黑色的酒萸肉中5-HMF含量则上升到0.954 4%～1.837%，呈现出5-HMF含量随色泽加深而逐渐升高的规律。同时也可说明，5-HMF不仅能够通过加热产生，在常温仓储条件下也可逐渐生成，说明Maillard反应在不加热条件下也可缓慢进行。这种在常温下伴随色泽的加深而出现5-HMF产生和增加的现象也见于牛膝的研究报道[8]。因此，我们建议对生品山茱萸进行5-HMF的限量检测。

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（收稿日期：2014-12-25）

（修回日期：2015-01-13；编辑：陈静）