雷公藤红素对HepG2细胞迁移的影响

杜娜 付建华 李健 刘福生 张寅 刘婷 苏泽琦 丁霞

摘要：目的 探索雷公藤紅素对HepG2细胞迁移较佳抑制作用浓度及时间。方法 将HepG2细胞铺于6孔板并培养，待贴壁细胞密度达到70%～80%后，采用划痕法制造细胞迁移模型，分为二甲基亚砜组及雷公藤红素5、1、0.5、0.1、0.01 μmol/L组，于0、6、12、24 h观察细胞形态及细胞迁移情况，拍照记录，计算细胞迁移速度及细胞迁移抑制率。结果 雷公藤红素对HepG2细胞迁移具有抑制作用，且其对细胞迁移抑制作用在一定范围内呈浓度依赖性，浓度越高其抑制细胞迁移的作用越明显。同一浓度不同作用时间高浓度雷公藤对HepG2细胞迁移的抑制作用差异有统计学意义（P<0.05）；同一时间不同浓度雷公藤红素对HepG2细胞迁移的抑制作用差异有统计学意义（P<0.05）；雷公藤红素高浓度组可使细胞形态发生改变。结论 高浓度雷公藤红素能使HepG2细胞形态发生改变并凋亡；雷公藤红素抑制了HepG2细胞迁移，且该抑制作用与浓度、时间相关，终浓度为5 μmol/L作用于HepG2细胞6 h时，其对HepG2细胞迁移抑制作用最明显。

关键词：雷公藤红素；细胞迁移；HepG2细胞；浓度；时间

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.07.015

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）07-0051-04

Effects of Celastrol on HepG2 Cells Migration DU Na1， FU Jian-hua2， LI Jian3， LIU Fu-sheng1， ZHANG Yin1， LIU Ting1， SU Ze-qi1， DING Xia3 （1.Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100700， China；2.Xiyuan Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100091， China；3.Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China）

Abstract：Objectives To explore a better inhibitory effect of concentration and time of Celastrol on migration of HepG2 cells. Methods HepG2 cells were planted and cultured in 6-well plates. When the adherent cell density reached 70%-80%， cell migration was manufactured by scratch experiment model. Then， cell morphology and cell migration were observed under microscope with different concentrations of Celastrol 5， 1， 0.5， 0.1， 0.01 μmol/L and DMSO at 0， 6， 12， 24 h. They were pictured and rates of cell migration and inhibition ratios of all groups were calculated. Results Celastrol inhibited HepG2 cell migration， and its inhibitory effect on the migration velocity was concentration-dependent in a certain range. The higher the concentration of Celastrol， the stronger effect is. Celastrol of the same concentration at different times had different inhibitory effect on cell migrationof HepG2 cells （P<0.05）. Celastrol of different concentrations at the same time had different inhibitory effects on cell migration of HepG2 cells （P<0.05）；Celastrol of high concentration cause dsevere changes in the cell morphology. Conclusion Celastrol of high concentration causes changes in the cell morphology and cell apoptosis of HepG2 cells. Celastrol inhibits HepG2 cell migration， which is dependent on the concentration and action time. The inhibitory effect of Celastrol on HepG2 cell migration is most obvious under final concentration of 5 μmol/L at 6 h.

Key words：Celastrol；cell migration；HepG2 cell；concentration；time

基金项目：国家自然科学基金（91129714、81270466）；教育部高等学校博士学科点专项科研基金（20120013110014）；

国际科技合作专项（2009DFA31010）

通讯作者：丁霞，E-mail：dingx@bucm.edu.com

恶性肿瘤是严重危害人类健康的重大疾病。侵袭和转移是肿瘤发生和演进过程中的重要问题，肿瘤的转移对于肿瘤治疗来说是一大难题。因此，能否控制肿瘤转移是决定患者预后的重要因素之一。细胞迁移参与组织形成、胚胎发育、炎症反应、伤口愈合、动脉粥样硬化等多种生理、病理过程，且贯穿于肿瘤转移的全过程，是肿瘤转移过程中的重要步骤[1]。因此，抑制细胞迁移能够抑制肿瘤的转移。雷公藤红素是从雷公藤中提取的有效成分之一，其抗肿瘤作用受到广泛关注。研究表明，其能够抑制PMA诱导的乳腺癌细胞侵袭和迁移[2]。本实验观察雷公藤红素对人肝癌HepG2细胞形态及细胞迁移的影响，并探索其对HepG2细胞迁移较佳抑制作用浓度和时间。

1 实验材料

1.1 细胞

HepG2细胞（人肝癌细胞）由中国中医科学院基础理论研究所惠赠。

1.2 药物

雷公藤红素，南京泽朗医药科技有限公司，批号ZL2014635；二甲基亚砜（DMSO），Sigma公司，批号1001731596。

1.3 主要试剂与仪器

RPMI Medium 1640、胎牛血清（FBS）、青-链霉素、谷氨酰胺、0.25%Trypsin-EDTA、磷酸盐缓冲液（PBS），GIBCO公司。培养箱（Thermo SCIENTIFIC HERACELL150i CO2 Incubator），超净台（Opti.MAIR），离心机（Centrifuge 5415D，Eppendorf），BT224S电子天平（德国Sartouris公司），-80 ℃冰箱（青岛海尔），HB-202恒温水浴箱（北京中西远大），MP200A电子天平（上海天平仪器厂），YDS-50型液氮罐（北京信康亿达科技发展有限公司）。

2 实验方法

2.1 细胞培养

细胞复苏后接种于培养皿，于饱和湿度下37 ℃、5%CO2培养箱培养；接种HepG2细胞于6孔板中，加入含10%FBS、1%青-链霉素、1%谷氨酰胺的RPMI Medium 1640培养基于饱和湿度下37 ℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞贴壁生长至70%～80%后，划痕法制造迁移模型，分别加入含药培养基3 mL，分别于作用后0、6、12、24 h观察细胞形态及细胞迁移情况。

2.2 细胞迁移实验方法及迁移能力测定

先用Marker笔在6孔板背后均匀划横线，在孔中加入约5×105个HepG2细胞，按“2.1项”方法进行细胞培养，用PBS洗细胞3次，去除划下的细胞。雷公藤红素以DMSO助溶，实验组分别稀释成浓度为5、1、0.5、0.1、0.01 mmol/L的液体，对照组为DMSO组，再以1∶1000分别加入各孔中，置入37 ℃、5%CO2培养箱培养，每组3个孔，每孔取12个视野，共计36个视野。分别于0、6、12、24 h取样，拍照观察细胞形态。应用Image J软件测量划痕之间距离，比较雷公藤红素对细胞迁移的影响。计算细胞迁移抑制率。细胞迁移抑制率（%）=（1-各实验组迁移距离/对照组迁移距离）×100%；细胞迁移速度的计算用0 h划痕边沿的距离减去χh划痕边沿的距离除以χh，得出不同时间段细胞迁移的速度[3]。

3 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行分析。部分数据不符合正态分布，细胞迁移计量资料各组间的多重比较采用非参数检验，所有数据均用“M（QR）”表示。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 雷公藤红素对HepG2细胞迁移速度的影响

经不同浓度（5、1、0.5、0.1、0.01 μmol/L）雷公藤红素处理0、6、12、24 h后，测定不同时间段细胞迁移距离，根据迁移距离计算速度。结果显示，与DMSO组比较， 除0.01 μmol/L组外，雷公藤红素各浓度组细胞迁移速度比较差异均有统计学意义（P<0.05）。结果见表1。

表1 各组HepG2细胞不同时间段迁移速度比较[M（QR），μm/h]

组别 0-6 h 0-12 h 0-24 h

DMSO组 11.85（0.61） 9.34（0.41） 6.38（0.21）

5 μmol/L组 5.14（0.52）*

1 μmol/L组 7.15（0.19）* 5.50（0.27）* 3.61（0.17）*▲

0.5 μmol/L组 8.77（0.54）*# 6.94（0.31）* 4.61（0.16）*△▲

0.1 μmol/L组 10.54（0.47）*#△ 8.43（0.27）*△ 5.64（0.21）*△☆▲

0.01 μmol/L組 11.93（0.43） 9.35（0.33） 6.35（0.20）

注：与DMSO组比较，*P<0.05；与5 μmol/L组比较，#P<0.05；与

1 μmol/L组比较，△P<0.05；与0.5 μmol/L组比较，☆P<0.05；与同组0-6 h时点比较，▲P<0.05（下同）

4.2 雷公藤红素对HepG2细胞迁移抑制率的影响

经不同浓度（5、1、0.5、0.1、0.01 μmol/L）雷公藤红素处理0、6、12、24 h后，测定不同浓度雷公藤红素对HepG2细胞迁移的抑制率。结果显示，与DMSO组比较，除0.01 μmol/L组外，雷公藤红素各浓度组细胞迁移速度抑制率差异均有统计学意义（P<0.05）。结果见表2。

4.3 雷公藤红素对HepG2细胞形态的影响

加入终浓度为5 μmol/L的雷公藤红素作用6 h时，部分HepG2细胞体变圆、缩小；作用12 h时大部分HepG2细胞体变圆、缩小；作用24 h时HepG2细胞体变圆、缩小，部分细胞成为碎片，培养基表面漂浮死细胞。加入终浓度为1 μmol/L的雷公藤红素，作用6、12 h时细胞基本正常生长；作用24 h时部分HepG2细胞体变圆、缩小，极少部分细胞成为碎片，培养基表面漂浮死细胞。加入终浓度为0.5、0.1、0.01 μmol/L的雷公藤红素作用6、12、24 h时细胞基本正常生长。结果见图1。

表2 各组HepG2细胞不同时间段迁移抑制率比较[M（QR），%]

组别 0-6 h 0-12 h 0-24 h

DMSO组 0 0 0

5 μmol/L组 56.49（4.10）*

1 μmol/L组 40.07（4.09）*# 40.77（3.63）* 43.18（3.06）*

0.5 μmol/L组 26.14（5.75）*#△ 25.37（3.97）*△ 27.39（3.69）*△

0.1 μmol/L组 11.25（5.73）*#△☆ 9.41（4.53）*△** 11.14（3.59）*△☆▲

0.01 μmol/L组 -0.66（6.05） -0.46（4.04） 0.61（3.78）

0 h 6 h 12 h 24 h

A

B

C

D

E

F

注：A.DMSO组；B.5 μmol/L组；C.1 μmol/L组；D.0.5 μmol/L组；

E.0.1 μmol/L组；F.0.01 μmol/L组

图1 不同浓度雷公藤红素作用不同时点HepG2细胞形态（×100）

5 讨论

《灵枢·刺节真邪》认为瘤的病因是“邪居其间，久而内着”。一般而言，临床采用清热解毒法者尤多，提示肿瘤的病理特点以热毒为多，即使起于寒毒，亦多从火化，而解毒药与攻毒类药合用可能具有拮抗制约中和等效应[4]。恶性肿瘤特别是中晚期有转移者常见发热、肿块增大、局部灼热、疼痛、口渴、便秘、舌红、苔黄、脉数等症，皆属邪热瘀毒之候，治疗当以清热解毒为法[5]。清热解毒药抗癌机理主要为直接抑制肿瘤、诱导肿瘤细胞凋亡、调节机体免疫功能、抗炎、解毒、退热、阻断致癌和防突变、抗氧自由基、逆转肿瘤细胞的耐药性等，并在肿瘤的临床治疗中得到广泛应用[6]。

雷公藤为卫矛科植物雷公藤的根，其味苦、辛，寒，归肝、肾经，功效祛风除湿、通络消肿止痛、解毒杀虫，苦寒可清热解毒，用于湿热结节、癌瘤积毒。雷公藤红素是其研究较多且较为主要的有效成分之一。雷公藤红素具有广泛的药理作用，其抗肿瘤作用受到了广泛关注。湛氏等[7]研究发现，雷公藤红素能够明显抑制鼻咽癌细胞株CNE-1的增殖；Tozawa K等[8]研究发现，雷公藤红素能够诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡，并使细胞停滞在G1期；Ge P等[9]发现，雷公藤红素能够抑制蛋白酶体的活性；Dai Y等[10]研究表明，雷公藤红素能够抑制雄激素非依赖型前列腺癌细胞的增殖、侵害和血管生成；雷公藤红素可以作用于重组人热激转录因子-1（HSF1）的DNA结合、HSF1的过磷酸化及热休克基因的转录激活[11]。另外有研究显示，雷公藤红素对部分多核转录因子具有双向调节作用，这种现象在其他热休克蛋白90抑制剂中未见报道[12]；吴氏等[13]观察到雷公藤红素可以改变Burkitt淋巴瘤细胞株Raji细胞膜超微结构；Yadav VR等[14]研究表明，雷公藤红素能够通过下调趋化因子受体CXCR4的表达而抑制结肠及胰腺癌细胞的侵入和转移。

本实验围绕不同浓度雷公藤红素在不同时间段对HepG2细胞形态及细胞迁移的影响进行了研究。结果表明，HepG2细胞在终浓度为5 μmol/L的雷公藤红素作用下，6 h内能够抑制HepG2的迁移，6-12 h时使细胞凋亡；在终浓度为1、0.5、0.1 μmol/L时均能够抑制HepG2细胞的迁移；在终浓度为0.01 μmol/L时对HepG2细胞迁移的抑制作用不明显。雷公藤红素对HepG2细胞迁移具有抑制作用，且其对迁移的抑制作用在一定范围内呈浓度依赖性，浓度越高其抑制细胞迁移速度的作用越强。

我们观察了同一浓度不同作用时间的雷公藤红素对HepG2细胞形态及细胞迁移的影响。结果表明，同一浓度雷公藤红素在不同时间对HepG2细胞形态及细胞迁移的抑制作用不同。终浓度为5 μmol/L的雷公藤红素作用于HepG2细胞6 h时，其对HepG2细胞迁移的抑制作用最明显，在作用12 h时，细胞出现凋亡。在雷公藤红素终浓度为1 μmol/L时，作用6、12 h时HepG2细胞基本正常生长；作用24 h时部分HepG2细胞出现凋亡，且对HepG2細胞迁移速度的抑制作用最明显。雷公藤红素终浓度为0.5、0.1 μmol/L时，HepG2细胞24 h内均基本正常生长，并对HepG2细胞迁移具有抑制作用，且在0-24 h时细胞迁移速度最慢。

我们还观察了同一时间不同浓度雷公藤红素对HepG2细胞形态及细胞迁移的影响。实验结果表明，同一时间不同浓度雷公藤红素对HepG2细胞形态的影响及细胞迁移的抑制作用不同。且在0-6 h时以终浓度为5 μmol/L的雷公藤红素对HepG2细胞迁移抑制作用最明显；在0-12 h时终浓度5 μmol/L的雷公藤红素使细胞产生凋亡，此时以终浓度为1 μmol/L的雷公藤红素对HepG2细胞迁移的抑制作用最明显；在0-24 h时以终浓度1 μmol/L的雷公藤红素对HepG2细胞的抑制作用最明显。

本研究结果表明，高浓度雷公藤红素能够使HepG2细胞形态发生改变并凋亡；雷公藤红素抑制了HepG2细胞的迁移，且该抑制作用与浓度、时间相关，且在终浓度为5 μmol/L作用于HepG2细胞6 h时，其对HepG2细胞迁移的抑制作用最明显。因此，从某种角度讲，雷公藤红素可以通过抑制细胞迁移而抑制肿瘤侵袭和转移。雷公藤红素属于清热解毒类药物，该研究结果符合恶性肿瘤特别是中晚期有转移者皆属邪热瘀毒之候，治疗当以清热解毒为法之说。故抑制肿瘤细胞迁移亦为清热解毒药抗癌机理之一，这在之前的研究较少涉及。另外，我们通过对雷公藤红素不同浓度、不同作用时间组与对照组进行比较来说明该药对细胞迁移的影响，还进行了各浓度组之间的多重比较，探索了雷公藤红素对HepG2细胞迁移较佳抑制作用浓度及时间。

本研究从细胞水平探索了雷公藤红素对肿瘤转移的影响及其较佳作用浓度和时间，其影响HepG2细胞迁移的作用机制值得进一步深入研究探讨。

参考文献：

[1] 张阿丽.细胞迁移调控因子Rho与肿瘤转移[J].国外医学：生理、病理科学与临床分册，2003，23（4）：365-367.

[2] kim Y， kang H， jang KW， et al. Celastrol inhibits cancer cell invasion via suppression of NF-κB-mediated matrix metalloproteinase-9 expression[J]. Cell Physiol Biochem，2011， 28（2）：175-184.

[3] Fairless R， Frame MC， Barnett SC. N-cadherin differentially determines Schwann cell and olfactory ensheathing cell adhesion and migration responses upon contact with astrocytes[J]. Mol Cell Neurosci，2005，28（2）：253-263.

[4] 周仲瑛，程海波.中醫药辨治肿瘤若干理念问题的探讨[J].南京中医药大学学报，2013，30（2）：101-104.

[5] 王淙悦.中医治疗肿瘤转移概况[J].实用中医内科杂志，2013，27（11）：81-83.

[6] 胡凯，葛卫红.雷公藤红素药理活性研究进展[J].亚太传统医药， 2011，8（11）：179-181.

[7] 湛达河，胡建兵，达世俭，等.雷公藤红素对鼻咽癌CNE-1细胞增殖抑制和放射增敏作用的初步研究[J].癌症进展，2010，8（5）：491-499.

[8] Tozawa K， Sagawa M， Kizaki M. Quinone methidetripterine， celastrol， induces apoptosis in human myeloma cells via NF-κB pathway[J]. International of Onology，2011，39（5）：1117-1122.

[9] Ge P， Ji X， Ding Y， et al. Celastrol causes apoptosis and cell cycle arrest in rat glioma cells[J]. Neurological Research，2010， 32（l）：94-100.

[10] Dai Y， Desano J， Tang W， et al. Natural proteasome inhibitor celastrol suppresses androgen-independent prostate cancer progression by modulating apoptotic and NF-κB[J]. PLoS one，2010， 5（12）：e14153.

[11] Shihua W， Cuirong S， Kuiwu W， et al. Preparative isolation and purification of celastrol from Celastrus orbiculatus Thunb. by a new counter-current chromatography method with an upright coil planet centrifuge[J]. J Chromatogr A，2004，1028：171.

[12] 吴霞，黄文华，郭宝林，等.雷公藤制剂中雷公藤红素的含量研究[J].中国中药杂志，2009，34（7）：836-838.

[13] 吴红，胡小毛，高杨军，等.雷公藤红素对Raji细胞表面超微结构与增殖活性的影响[J].第二军医大学学报，2012，3（8）：856-859.

[14] Yadav VR， Sung B， Prasad S， et al. Celastrol suppresses invasion of colon and pancreatic cancer cells through the down regulation of expression of CXCR4 chemokine receptor[J]. Journal of Molecular Medicine （Berlin， Germany），2010，88（12）：1243-1253.

（收稿日期：2015-01-04）

（修回日期：2015-02-04；编辑：华强）