硅胶固相萃取—高效液相色谱法检测油炸肉制品中的丙烯酰胺

郑卫 徐世明 赵瑞连 张建梅 郭光平 孙承锋 王光杰

摘 要：实验建立一种利用硅胶固相萃取-高效液相色谱来检测油炸肉制品中丙烯酰胺的含量的方法。采用硅胶作为萃取材料对样品提取液进行净化，利用高效液相色谱进行检测。结果表明：检测波长为205 nm，流动相为甲醇-水（5∶95，V/V），流速为0.8 mL/min。方法加标回收率为73.5%～80.8%，相对标准偏差≤5.54%，最低检出限为10 ng/mL。该方法简便、可靠，满足油炸肉制品中丙烯酰胺的检测要求。

关键词：油炸肉制；硅胶；固相萃取；高效液相色谱

Detection of Acrylamide in Fried Meat Products by Silica Gel Solid Phase Extraction-High Performance Liquid Chromatography

ZHENG Wei1， XU Shiming2，*， ZHAO Ruilian2， ZHANG Jianmei2， GUO Guangping2， SUN Chengfeng1，

WANG Guangjie2

（1.Institute of Food Science and Engineering， Yantai University， Yantai 264005， China；

2.Yantai Xiwang Food Co. Ltd.， Yantai 264002， China）

Abstract： This paper presents a silica gel solid phase extraction-high performance liquid chromatography （HPLC） method to detect the content of acrylamide in fried meat products. The extract was cleaned up by solid phase extraction using silica gel as the adsorbent prior to being analyzed by HPLC. The detection wavelength was set at 205 nm. The separation was performed using a Kromisil C18 （250 mm × 4.6 mm， 5 ?m）. The mobile phase used was a 5：95 （V/V）mixture of methanol and water at a flow rate of 0.8 mL/min. Recoveries of the proposed method for spiked samples ranged from 73.5% to 80.8%， with relative standard deviation （RSD） no greater than 5.54% （n = 5）. The limit of detection was 10 μg/mL （S/N = 3）. This method is simple and reliable， and can be used for the detection of acrylamide in fried meat products.

Key words： fried meat products； silica gel； solid phase extraction； high performance liquid chromatography （HPLC）

中圖分类号：TS251.1 文献标志码：A 文章编号：

doi： 10.7506/rlyj1001-8123-201508001

丙烯酰胺是一种极性小分子物质，相对分子质量为71.08，易溶于水、甲醇、乙醇、丙酮[1]，微溶于乙酸乙酯，不溶于苯基庚烷[2]。2002年瑞典科学家首次在食品中发现丙烯酰胺[3]，由于丙烯酰胺对人体有潜在致癌性[4-6]、神经毒性[7-9]、生殖毒性[9-10]等多重毒性[11]，而引起了各国科研人员的关注，进而掀起了研究丙烯酰胺的热潮。目前关于丙烯酰胺的研究大多集中于薯类[13-14]及淀粉类食品[15-17]，肉类制品的研究较少。由于肉制品由于富含蛋白质，也含有氨基酸和糖类物质，在高温加工过程中发生美拉德反应而产生丙烯酰胺[18]，因此油炸肉制品中丙烯酰胺含量的研究具有实际意义。章宇等[19]利用液相色谱-串联质谱法检测了两组油炸鸡翅中丙烯酰胺的含量，结果分别为146.6 μg/kg和213.5 μg/kg，陈旭明等[20]利用气相色谱-质谱联用法检测了炸鸡腿及炸鸡骨中丙烯酰胺的含量，检测结果分别为365 μg/kg和703 μg/kg。

目前丙烯酰胺的主要检测方法是气相色谱-质谱联用[21-22]和液相色谱-质谱联用[23-24]。气相色谱-质谱联用需要衍生，实验耗时长，操作繁琐；液相色谱-质谱联用费用昂贵，不利于推广[25]。实验以油炸肉制品为研究对象，建立了一种硅胶固相萃取-高效液相色谱检测油炸肉制品中丙烯酰胺的方法，该方法简便、可靠，满足油炸肉制品中丙烯酰胺的检测需求。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

油炸肉制品购自学校周边市场。

丙烯酰胺标准品（≥99.9%） 中国计量科学研究院；甲醇（液相色谱级） 德国默克股份公司；硅胶（分析纯） 青岛邦凯分离材料有限公司；针式过滤头（0.22 ?m，有机相） 上海安谱科学仪器有限公司；超纯水自制。

1.2 仪器与设备

Agilent1100高效液相色谱仪 安捷伦科技有限公司；旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；分析天平 德国赛多利斯集团；WH-3微型旋涡混合仪 上海沪西分析仪器厂；TG16-WS离心机 长沙湘智离心机仪器有限公司；HH-4数显恒温水浴锅 国华电器有限公司；粉碎机 青岛汉尚电器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

准确称取适量粉碎均匀的样品于锥形瓶中，加入40 mL正己烷振荡10 min以除去脂肪，弃去正己烷，并挥发干残余的正己烷，加入40 mL甲醇溶液，振荡提取30 min，重复提取2 次，合并提取液，6 000 r/min离心15 min，将上清液转移入平底烧瓶中，用旋转蒸发仪蒸干，加入30 mL乙酸乙酯提取，重复2 次，合并乙酸乙酯溶液于锥形瓶中，加入3.0 g硅胶，50 ℃条件下萃取1.0 h，蒸干乙酸乙酯，得到萃取后的硅胶，用60 mL甲醇分3 次对所得到的硅胶进行洗脱，收集洗脱液并用旋转蒸发仪浓缩，定容至5 mL，高效液相色谱检测前用0.22 ?m有机相滤膜过滤。

1.3.2 高效液相色谱检测条件

色谱柱：Kromisil C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流动相：甲醇-水（5∶95，V/V）；流速：0.8 mL/min；进样量：20 ?L；柱温：40 ℃；检测波长：205 nm。依据保留时间进行定性，峰面积进行定量。

2 结果与分析

2.1 高效液相色谱条件的确立

2.1.1 检测波长的确定

用紫外分光光度计对5.0 μg/mL的丙烯酰胺标准溶液在190～300 nm波长范围内进行连续检测，根据得到的连续吸光度变化图，得知丙烯酰胺在205 nm附近有最大吸收值，由于高效液相色谱仪上的紫外检测器与紫外分光光度计存在差异，因此再利用高效液相色谱对丙烯酰胺标准溶液205 nm和210 nm进行检测，由图1可知，205 nm处峰面积明显比210 nm要大，因此选择205 nm作为丙烯酰胺的检测波长。

2.1.2 流动相的选择

分别用超纯水、甲醇-水（3∶97，V/V））、甲醇-水（5∶95，V/V）作流动相进行检测，观察峰型及保留时间，超纯水作流动相时峰宽较大，此外纯水作流动相对C18色谱柱会产生不良影响；甲醇-水（3∶97，V/V）时，峰型尚好，但是对样品进行检测时，试样中的丙烯酰胺未能分离出来；甲醇-水（5∶95，V/V）时，峰型良好，也能将试样中的丙烯酰胺分开，因此选择流动相为甲醇-水（5∶95，V/V）。

2.1.3 流速的选择

通过设置流速0.5、0.8、1.0 mL/min比较3 种流速对丙烯酰胺保留时间、峰型的影响，由图2可知，流速对保留时间、峰型有影响，流速增大，保留时间减小；流速降低，保留时间变大，峰宽增大。0.5 mL/min时，峰宽较大，保留时间较大，而1.0 mL/min时，保留时间偏小，因此流速选择0.8 mL/min。

2.2 样品预处理条件的优化

通过对水、甲醇、乙醇3 种提取溶剂进行对比，结果表明，乙醇在丙烯酰胺保留时间处有峰出现，因此排除乙醇，水及甲醇均对检测无干扰，考虑到用甲醇提取后更利于浓缩，故选取甲醇提取溶剂。然后采用固相萃取法对提取液进行净化，实验比较了活性炭、C18和硅胶3种固相材料的萃取效果，结果表明硅胶的萃取和净化效果最好，因此实验选择硅胶作为净化材料。

2.3 标准曲线的绘制

取适量丙烯酰胺标准使用溶液配制成质量浓度分别为5.0、2.0、1.0、0.5、0.2、0.1 ?g/mL的标准溶液，过膜后进行检测，丙烯酰胺保留时间为6.02 min。以各质量浓度丙烯酰胺标准所得峰面积为纵坐标，以相應的质量浓度为横坐标作曲线，标准曲线方程为y=232.48x-3.014 6，R2=0.999 6。曲线方程显示丙烯酰胺质量浓度在0.1～5.0 ?g/mL范围内线性关系良好，

2.4 精密度、回收率与检出限

选择0.1、1.0、5.0 ?g/mL这3 个质量浓度的标准溶液，分别连续进样5 次，计算得到3 个质量浓度测定的相对标准偏差，结果如表1所示。分别取含有3、5、7 ?g的丙烯酰胺的标准溶液按照样品提取方法进行提取、净化并进行检测，计算其回收率，结果如表2所示。

实验以3 倍信噪比（RS/N）作为基准，取低质量浓度的标准溶液逐级稀释，测得丙烯酰胺的最低检测限为10 ng/mL。

2.5 实际样品检测

按照1.3.1节的前处理方法对样品进行前处理，然后在1.3.2节高效液相色谱条件下进行检测。实际样品的丙烯酰胺含量检测结果如表3所示。

3 结 论

本实验采用硅胶固相萃取-高效液相色谱法检测油炸肉制品中的丙烯酰胺。利用硅胶作为固相萃取材料对样品提取液进行净化，较好的去除杂质的干扰；通过对高效液相色谱检测条件进行优化，使得样品中丙烯酰胺得到了较好的分离。方法的加标回收率为73.5%～80.8%，相对标准偏差≤5.54%，最低检出限为10 ng/mL，满足油炸肉制品中丙烯酰胺的检测要求。

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