阳和汤对兔膝骨关节炎模型关节液中SOD、NO的影响

2015-05-30许波徐志斌洪振强

风湿病与关节炎 2015年9期

许波徐志斌洪振强

【摘要】目的：通過观察阳和汤对兔膝骨关节炎模型关节液中超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮（NO）的影响，探讨阳和汤防治骨关节炎的作用机制。方法：将24只健康新西兰兔随机分为阳和汤组、阳性对照组、模型对照组、空白对照组，每组6只。除空白对照组外，其余各组均采用木瓜蛋白酶造模方法建立骨关节炎模型。阳和汤组以阳和汤灌胃，阳性对照组以筋骨痛消丸灌胃，空白对照组、模型对照组以生理盐水灌胃，每日1次，持续给药5周。采用HE染色观察软骨形态结构的变化，用酶联免疫吸附法（ELISA法）检测关节液中SOD、NO含量的变化。结果：HE染色：软骨形态结构阳和汤组与阳性对照组明显优于模型对照组。关节软骨组织损伤Mankin's评分：与空白对照组比较，其余3组评分明显增加

（P < 0.05）；阳和汤组、阳性对照组与模型对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）；阳和汤组与阳性对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。ELISA检测法：阳和汤组与阳性对照组关节液中SOD含量均高于模型对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）；阳和汤组与阳性对照组关节液中NO含量均低于模型对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。结论：阳和汤可以通过升高兔膝骨关节炎模型关节液中SOD含量，降低其NO含量，从而对膝骨关节炎起到治疗作用。

【关键词】骨关节炎；阳和汤；兔；关节液；SOD；NO

doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2015.09.002

Effect of Yanghe Decoction（阳和汤） on SOD and NO in the Synovial Fluid of Rabbits with Knee Osteoarthritis

XU Bo，XU Zhi-bin，HONG Zhen-qiang

【ABSTRACT】 Objective：To study the mechanism of Yanghe Decoction （阳和汤） in the prevention and treatment of osteoarthritis by observing its effect on SOD and NO in the synovial fluid of rabbits with knee osteoarthritis.Methods：24 healthy New Zealand rabbits were randomly divided into a Yanghe Decoction group，a positive control group，a model control group and a blank control group，6 rats in each.Except for the blank control group，the other groups were used to establish ostarthritis models with papain.The Yanghe Decoction group was given intragastric administration with Yanghe Decoction，the positive control group with Jingu Tongxiao Pill （筋骨痛消丸） and the model control group and blank control group with physiological saline，once a day for five weeks.HE staining was used to observe the changes of the morphosis of cartilage，and ELISA was used to detect the changes of SOD and NO in synovial fluid.Results：HE staining：The cartilage morphosis in the Yanghe Decoction group and the positive control group was significantly better than that of the model control group.Mankin score of articular cartilage tissue injury：Compared with the blank control group，the integrals in the other three groups increased significantly （P < 0.05）；the differences of that between Yanghe Decoction group，the positive control group and the model control group were statistically significant （P < 0.05）；the difference of that between the Yanghe Decoction group and the positive control group was not statistically significant （P > 0.05）.ELISA：The content of SOD in the Yanghe Decoction group and the positive control group was higher than that in the model control group，the difference being statistically significant （P < 0.05）；the content of NO in the Yanghe Decoction group and the positive control group was lower than that in the model control group，the difference being statistically significant （P < 0.05）.Conclusion：Yanghe Decoction can be used to treat knee osteoarthritis by increasing the content of SOD and decreasing the content of NO in the synovial fluid.

【Keywords】osteoarthritis；Yanghe Decoction（阳和汤）；rabbit；synovial fluid；SOD；NO

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种由多种因素引起的以关节软骨的变性、破坏及骨质增生为特征的慢性关节疾病，又称骨关节病、退行性关节

病[1]。有調查研究显示，在我国老龄人群中，

65岁以上人群OA发病率超过50%，75岁以上人群则高于80%[2]。OA引起关节不适和疼痛，导致日常活动能力下降，后者引起肌肉衰弱，进一步削弱日常活动能力，引发恶性循环。正常情况下，关节软骨基质的降解和修复处于一种持续的动态平衡状态，并受体内多种蛋白分子的调节和控制[3]。已有研究表明，阳和汤可通过维持软骨的动态平衡，延缓OA软骨退变[4]。但对兔膝OA模型关节液中超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮（NO）的影响仍需进一步验证，故本文旨在探讨阳和汤防治OA的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物新西兰兔24只（合格证号2007001103277），清洁级，体质量2.5～3.5 kg，雌雄各半，上海市松江区松联实验动物场提供，许可证号SCXK（沪） 2012-0011。福建中医药大学实验动物中心提供清洁级医学实验动物环境设施，许可证号SCXK（闽）2012-0001。

1.2 药品、试剂与仪器阳和汤[药物组成：熟地黄30 g、肉桂（去皮研粉）3 g、麻黄2 g、鹿角胶9 g、白芥子6 g、姜炭2 g、生甘草3 g。由福建中医药大学国医堂提供]；筋骨痛消丸（河南省洛药制药厂生产，国药准字Z10970117）；木瓜蛋白酶（美国Sigma公司，批号107147）；兔SOD、兔NO酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒（上海西唐生物科技有限公司）；酶标分析仪、离心机及光镜等相关实验仪器由福建中西医结合研究院提供。

2 方法

2.1 动物分组将24只4～6月龄健康新西兰兔随机分为阳和汤组、阳性对照组、模型对照组、空白对照组，每组6只。

2.2 造模方法除空白对照组外，其余3组均参照文献[5-6]制备OA模型：用质量分数为2%的戊巴比妥钠30 mg·kg-1静脉注射麻醉后，双后腿膝关节周围剃毛；用质量分数为10%的异丙醇消毒皮肤，轻度弯曲膝关节，经关节正中或两侧进针；将质量分数为1.6%的木瓜蛋白酶生理盐水溶液0.5 mL通过髌上韧带注入兔膝关节腔，隔3日1次，连续注射3次。每日强迫动物活动30 min，分2次进行，连续驱赶4周后可获得OA模型。实验过程中，造模成功率100%。

2.3 药物干预造模4周后，空白对照组和模型对照组给予等量生理盐水灌胃，阳性对照组、阳和汤组分别给予筋骨痛消丸和阳和汤灌胃，每日1次，连续给药5周。每次用量根据Meeh-Rubner公式：A = K×W2/3×10-4，按成人体表面积与家兔体表面积换算[7]。

2.4 标本的采集与制备标本采集前各组动物禁食24 h，在耳缘静脉注射质量分数为2%的戊巴比妥钠30 mg·kg-1进行全身麻醉。空气栓塞处死实验动物后，行髌骨内缘纵行切口，逐层分离，保持术区无出血，分离至关节囊，反复屈伸活动关节，将关节液挤压至髌上囊内侧，在关节液最集中处轻轻划开关节囊，向内注入质量分数为0.9%的氯化钠注射液1.5 mL，反复抽吸10遍，尽量将液体抽出，注入1.5 mL EP管中，4 ℃置于15 000 r·min离心机离心15 min，取上清液，冷藏于-80 ℃的冰箱内待测[8]。取双膝关节股骨髁，用质量分数为4%的多聚甲醛固定，常规脱钙、包埋和切片，采用HE染色，观察软骨组织形态的变化。

2.5 检测方法

2.5.1 HE染色切片脱蜡至水，苏木素染液染色30 min，用质量分数为1%的盐酸酒精分化液分色3 s，用质量分数为0.5%的伊红液染色5 s，脱水透明封片，观察软骨结构形态。参考Mankin's骨关节病组织学分级方法进行评分。

2.5.2 ELISA法检测关节液中SOD、NO含量严

格按照试剂盒使用说明书，以标准品浓度作为横坐标，OD值作为纵坐标，计算标准曲线的4-Parameter回归方程，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

2.6 统计学方法采用SPSS 18.0软件进行统计分析。计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 HE染色空白对照组软骨基质染成粉红色，着色均匀，软骨细胞核呈深蓝色，胞浆呈粉红色，软骨表面光滑，表层细胞较小，呈长扁形，平行于软骨表面排列；移行层细胞较大，呈圆形或椭圆形；放射层细胞趋于柱状排列，散在分布。细胞排列整齐，四层结构清晰，潮线完整，见图1（1）。模型对照组软骨表面粗糙不整，表层软骨破裂、缺损、凹凸不平，有簇集现象，细胞排列紊乱，四层结构不清晰，潮线多不清晰、完整，见图1（2）。阳和汤组和阳性对照组差别较小，关节软骨表面存在表浅裂隙，但较模型对照组有一定程度的修复，软骨细胞排列轻度紊乱，未见大量软骨细胞簇集，可见软骨细胞增生，潮线清晰、完整程度较模型对照组改善，见图1（3）、图1（4）。

3.2 各组关节软骨组织损伤Mankin's评分结果

与空白对照组比较，其余3组明显增加（P < 0.05）；阳和汤组、阳性对照组与模型对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）；阳和汤组与阳性对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

表1 各组关节软骨组织损伤Mankin's评分结果分，

组别动物数（只） Mankin's评分

空白对照组 6 1.51±0.62

模型对照组 6 10.67±2.151）

阳和汤组 6 7.21±1.941）2）

阳性对照组 6 7.04±1.471）2）3）

注与空白对照组比较，1）P < 0.05；与模型对照组比较，2）P < 0.05；与阳和汤组比较，3）P > 0.05

3.3 各组关节液中SOD和NO的含量比较与空白对照组比较，模型对照组关节液中SOD活性显著下降（P < 0.01），NO含量显著升高（P < 0.01）；阳和汤组与阳性对照组SOD含量明显高于模型对照组（P < 0.05），NO含量明显低于模型对照组

（P < 0.05）；阳和汤组与阳性对照组SOD、NO含量比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。

表2 各组关节液中SOD和NO的含量比较

组别动物数

（只） SOD

（μg·mL-1） NO

（μmol·L-1）

空白对照组 6 71.74±1.93 55.84±2.78

模型对照组 6 52.78±1.751） 87.89±2.261）

阳和汤组 6 63.54±0.282） 74.21±0.442）

阳性对照组 6 64.57±1.342）3） 73.67±0.982）3）

注与空白对照组比较，1）P < 0.01；与模型对照组比较，2）P < 0.05；与阳和汤组比较，3）P > 0.05

4 讨论

目前，OA发病机制尚未十分明确，随着对OA研究的不断深入，在分子水平上对本病有了新的认识，发现细胞因子与之有着密切的联系，在OA发病过程中起着重要作用。NO是一种不稳定的自由基，是在一氧化氮合酶（NOS）的作用下由L-精氨酸合成而来。NOS有组织型（cNOS）和诱导型（iNOS）2种形式，在细胞因子的作用下，一般以iNOS为主。OA时，滑膜中丰富的血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等在炎性细胞因子作用下就会激活软骨母细胞中的NOS而产生大量NO。高浓度NO一方面抑制软骨细胞增殖，使软骨细胞修复能力低下；另一方面还促进软骨细胞糖酵解，产生ATP，使细胞外基质合成减少，无法承载正常的负荷，从而加速软骨破坏[9-10]。在OA患者及动物模型的关节中诱导型氮氧化物合酶高频率表达，关节液及血清NO水平升高，从而抑制胶原蛋白和蛋白多糖合成，诱导细胞凋亡，导致软骨退行性变和滑膜炎症[11]。同時，近年来的研究表明，氧化应激以及由此而产生的氧自由基，在OA的发病机制中起重要作用。人体自由基防御系统可将机体代谢所产生的自由基及时清除[12]，而OA病理状态下氧自由基含量增高，过量的氧自由基可抑制软骨细胞的增殖，抑制软骨基质蛋白多糖和胶原的合成，加速软骨基质降解，引起软骨细胞死亡，从而导致软骨损伤[13]。SOD是一种清除超氧阴离子自由基的重要抗氧化酶，使脂质过氧化反应得到抑制，从而保护滑膜和软骨细胞免受

损伤[14]。

可见，软骨细胞的凋亡与NO水平升高相关。软骨细胞作为膝关节软骨中的唯一细胞，抑制NO的产生或升高SOD均可抑制软骨细胞的凋亡，从而抑制关节软骨的破坏，延缓OA的发病进程。

OA多发于年高、体肥之人，体肥之人素体多痰，机制多为年老久病，肝肾亏虚，筋脉失于濡养，感受风寒湿之邪，寒湿痰瘀乘袭，气滞血瘀，寒痰、瘀血互结，痹阻筋骨，瘀阻脉络而成，属“本虚标实”之证。阳和汤中地黄温补营血，补肾填精；鹿角胶补肾助阳，益精血，强筋骨，二者共为君药。肉桂、炮姜炭温阳气，散寒凝，通经脉，畅血行，为臣药。白芥子温化寒痰，通络散结；麻黄宣通经络，开散寒凝，为佐药。诸药合用，共奏温阳散寒、温补营血、温化寒痰、通滞之功效。临床研究发现，阳和汤治疗膝OA取得了较好的疗效[15]。筋骨痛消丸是根据平乐正骨验方研制而成的中药制剂，药物组成包括丹参、香附、桂枝、白芍、牛膝等，具有活血行气、温经通络、消肿止痛的作用，临床已广泛推广运用[16]。

本实验研究表明，阳和汤能有效提高兔膝OA关节液中SOD的表达水平，从而减轻超氧自由基及其代谢产物对关节软骨的损伤；且通过降低其炎症因子NO的含量，从而保护软骨细胞及基质，延缓关节软骨退变的进展，达到治疗OA的作用。但其具体的分子调控机制，有待于更深入的实验研究。

5 参考文献

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