海南龙血树DcbHLH1的克隆与表达分析

曹天骏等

摘 要 碱性螺旋-环-螺旋（basic/helix-loop-helix，bHLH）转录因子在真核生物的生长发育过程中起着重要的调控作用。在前期龙血树转录组测序结果基础上克隆了1个海南龙血树bHLH转录因子基因，命名为DcbHLH1。序列分析显示，DcbHLH1阅读框基因序列长1 080 bp，编码360个氨基酸，推测分子量为39 ku，等电点为8.21。氨基酸序列比对结果显示，DcbHLH1具有bHLH转录因子家族保守的HLH结构域。进化分析结果表明，DcbHLH1和中粒咖啡中的bHLH亲缘关系最近。定量PCR结果表明，DcbHLH1在诱导剂处理后3 d内表达量快速下降，到第6天达到最低，与转录组测序的数字表达谱一致。DcbHLH1在海南龙血树的根、茎、叶等组织中均有表达，但在叶中表达量较高，根中表达量最低。结果为进一步分析DcbHLH1在龙血树中的功能奠定了基础。

关键词 海南龙血树；bHLH转录因子；克隆；差异表达

中图分类号 Q78 文献标识码 A

Cloning and Expression of DcbHLH1 in Dracaena cambodiana

CAO Tianjun1，2，DAI Haofu2， LI Huiliang2， GUO Dong2

MEI Wenli2 *， PENG Shiqing2 *

1 College of Agriculture， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

2 Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops， Ministry of Agricultur， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract Basic/helix-loop-helix gene（bHLH）is a transcription factor in the regulation of plant growth and development. In this study， a new gene coding for bHLH， designated as DcbHLH1， was cloned using the result of RNA-seq. Sequence analysis revealed the full-length cDNA of DcbHLH1 is 1 080 bp， encoding 360 amino acid residues with molecular mass of 39 ku， and pI 8.21， predicted tertiary structure contained a structure of helix-loop-helix. Evolution analysis showed that the DcbHLH1 and bHLH of Coffea canephora were the closest relative. The results of real time PCR analysis indicated that DcbHLH1 expressed at different levels with the highest transcription in the leaf， followed by the stem， and lowest in the roots. And the transcription of DcbHLH1 was decreased strongly in the stem by injection of induction solution at 3 days and 6 days. This research lays a foundation for studying the gene expression pattern and corresponding regulating mechanisms.

Key words Dracaena cambodiana； Basic/helix-loop-helix transcription factor； Clone； Differential expression

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.09.009

血竭是一种红色树脂，古今中外被广泛的应用在传统医学当中[1]。海南龙血树（Dracaena cambodiana Pierre ex Gagnep.）是国产血竭基源植物之一[2]。海南龙血树主要分布在海南省的三亚、陵水、万宁等地，国外也有较少的分布。天然血竭具有广泛的药用活性，如抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、止血、止腹泻、抗溃疡等活性[3]。化学成分分析表明，血竭中富含黄酮类物质，如黄酮、黄烷、查尔酮、高异黄酮等[4-8]。早期的研究表明，真菌能够诱导龙血树产生血竭[9-10]，但对于龙血树中这类黄酮物质的大量产生和积累机理并不清楚。同时在龙血树组织培养技术发展过程中发现海南龙血树组培苗能在6-BA刺激下产生血竭[11-12]。故可推测是植物体对抗外界不适宜环境所发生相应的保护反应产生的。本课题组利用自主创新的“无机盐诱导剂输液法”成功诱导了海南龙血树茎部黄酮物质积累（专利申请中）。黄酮类物质代谢是植物抗病机理中重要的代谢途径。黄酮类化合物的合成底物来自于苯丙素代谢产生的香豆酰CoA和脂肪酸代谢产生的丙二酰CoA，然后经过一系列其他骨架合成酶和结构修饰酶的作用，形成结构不同，活性不同的黄酮类化合物[13]。

目前对血竭的研究主要集中在化学成分和药理分析，而对血竭形成的分子机制尚未见报道[14-15]。本课题组利用无机盐诱导剂处理海南龙血树，并对诱导前后龙血树树干进行了转录组测序分析，旨在通过转录组高通量模式挖掘血竭形成的功能和调控基因，从分子水平阐明血竭的生物合成及其调控机制。本研究运用转录组数据，成功克隆了1个海南龙血树碱性螺旋-环-螺旋（basic/helix-loop-helix， bHLH）转录因子基因DcbHLH1，并进行了相关生物信息学和表达分析，为进一步研究龙血树中bHLH转录因子在黄酮类生物合成途径中的作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 3年生海南龙血树种植于中国热带农业科学院热带生物技术研究所，采集根、茎、叶后立即用液氮冻存备用。

1.1.2 质粒、试剂和菌种 克隆载体pMD19T simple Vector、限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit、Advantage 2 PCR Kit和实时荧光定量PCR试剂SYBRR Premix Ex TaqTMⅡ等均购自TaKaRa公司。E.coli DH5α由本实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 海南龙血树bHLH基因的搜索和分析 对无机盐诱导剂处理前后的3年生海南龙血树茎转录组进行测序分析，通过Swissprot、非冗余核酸数据库、非冗余的蛋白数据库和京都基因与基因组数据库（KEGG）公共数据库（E≤1×10-5）比对获得了注释结果。根据KEGG注释的基因功能信息，对参与次生代谢的序列（按次生代谢物种类）进行分类。再对所有注释信息进行整理，搜索数字表达谱中转录因子中变化差异较大的基因。

1.2.2 海南龙血树总RNA的提取和cDNA合成

取健康海南龙血树的根、茎、叶，在液氮中研磨，依据蔡文伟等[18]方法提取总RNA，利用NanoDrop 2000分光光度仪测定含量和1%琼脂糖凝胶电泳检测完整性。按照TaKaRa公司的M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书操作将总RNA反转录为第一链互补链DNA（cDNA）。

1.2.3 海南龙血树DcbHLH1的克隆 从龙血树转录组数据中获得1个由13条表达序列标签拼接而成的1 180 bp的序列，经注释分析发现此序列是具有完整开放阅读框和保守的bHLH结构域，定名为DcbHLH1。依据其两端序列设计一对引物（表1），以cDNA为模板对DcbHLH1进行扩增。反应体系：在0.2 mL离心管中加入1 μL cDNA、10×PCR反应缓冲液（含MgCl2）2 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、10 μmol/L引物各0.3 μL、Taq DNA聚合酶0.2 μL，加ddH2O至20 μL。反应条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 20 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，共35个循环；最后72 ℃延伸5 min。PCR产物纯化后克隆至载体pMD19T上，转化大肠杆菌DH5α，抽提质粒，测序由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成。

1.2.4 DcbHLH1信息学分析 采用ExPASy Proteomics Server在线工具Protparam（http：//www.expasy.ch/tools/protparam.html）对DcbHLH编码蛋白的理化性质预测；利用http：//www.predictprotein.org/和http：//swissmodel. expasy.org/在线分析DcbHLH1二级结构和结构域的三维建模；利用ClustalW软件和MEGA 5.2软件进行氨基酸序列比对和构建系统进化树。

1.2.5 海南龙血树DcbHLH1的表达分析 根据荧光定量引物设计原则，在不保守区域内设计DcbHLH1的定量引物（表1），以海南龙血树ACT基因[19]作为内参基因，使用SYBR Green I 荧光染料法进行分析。每个样品设3个重复。反应体系中含有5 μL SYBR Premix Ex Taq酶，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，模板（50 mg/L）0.5 μL，ddH2O 3.5 μL，总体10 μL。反应程序： 95 ℃预变性10 min； 95 ℃变性30 s， 59 ℃退火/延伸30 s，45个循环； 95 ℃变性10 s，65～95 ℃做熔解曲线分析，每个温度以每步0.5 ℃上升，每个温度停留5 s。试验数据通过Excel进行分析，获得DcbHLH1的相对表达量。

2 结果与分析

2.1 DcbHLH1的克隆

根据转录组数据，通过PCR方法获得1个1 080 bp的DcbHLH1（图1）。序列分析结果表明，获得的序列与转录组数据一致。

2.2 DcbHLH1编码蛋白特性分析

DcbHLH1全长1 080 bp，编码360个氨基酸（图2）。推导的DcbHLH1相对分子质量为39 ku，等电点pI8.21； 带正电残基（Arg+Lys）为43，负电残基（Asp+Glu）为45。该蛋白的不稳定系数为60.74，脂肪系数为78.08，亲水性系数为-0.470。二级结构在线预测结果表明，有73 个氨基酸参与形成α-螺旋（alpha helix），占所有氨基酸的20.33%，有32个氨基酸参与形成伸展链（extended strand），占总氨基酸的8.91%，另有255 个氨基酸参与形成无规则卷曲（random coil），占总氨基酸的70.75%。利用SWISS-MODEL 进行三维结构预测，该模型有bHLH转录家族共有的螺旋环螺旋结构（图3），以1nkp.2.C（1.80 A）蛋白为模板，序列同源性为30%。

2.3 DcbHLH1蛋白序列比对及进化分析

对海南龙血树、油棕（Elaeis guineensis）、海枣（Phoenix dactylifera）、小果野芭蕉（Musa acuminata）、小米（Setaria italica）、荷花（Nelumbo nucifera）、大麦（Hordeum vulgare）、玉米（Zea mays）、水稻（Oryza sativa）、节节草（Aegilops tauschii）、苹果（Malus domestica）、中粒咖啡（Coffea canephora）、野草莓（Fragaria vesca）等13个物种的22个bHLH进行了同源比对，发现在DcbHLH1的172到231号氨基酸存在核心的HLH结构域（图4）。对这22个不同物种的bHLH进行分子进化分析， 发现DcbHLH1和中粒咖啡CcbHLH1的亲缘关系最近，与同是单子叶植物的玉米、大麦、水稻亲缘关系较远（图5）。

2.4 DcbHLH1的表达分析

qRT-PCR结果表明，DcbHLH1在未处理的健康海南龙血树中表达量较高，在诱导处理的3 d内表达水平显著降低，到第6天时基因表达量最低，为对照组表达水平的0.013倍（图6）。与课题组前期的数字表达谱结果一致。DcbHLH1在所有组织中均有表达，其中在叶中表达量最高，茎次之，在根中表达量最低。

3 讨论与结论

bHLH转录因子是一类含有众多成员的重要转录因子，其结构域具有与DNA结合和与bHLH蛋白形成同源或异源二聚体的能力，在植物和动物中都有十分重要的转录调控作用[16-19]。在植物中bHLH通常识别靶标DNA上的E-box（由6个碱基CANNTG排列的特殊回文序列）[18]。植物bHLH转录因子既可以作为转录激活子又能作为转录抑制子发挥生物学作用，并且作用方式多种多样。在拟南芥中bHLH转录因子能和R2R3类的MYB、WD40转录因子形成调控复合体，调控拟南芥中黄酮类化合物的生物合成[16]。在玉米中也发现bHLH转录因子调控种子和根中的黄酮代谢途径[17]。Valderrama等[20]发现在草莓成熟过程中bHLH的表达量变化与着色变化一致，推测其在黄酮类物质合成中起着主要的调控作用。将玉米调控茎干颜色的bHLH基因转化到矮牵牛花中，强烈地促进了植物花萼的着色[21]，表明bHLH基因参与了次生代谢调控。在苹果和梨等果树中， bHLH参与了低温和紫外线诱导的花青苷的合成， 促进果实着色[22-23]。另外，拟南芥中发现茉莉酸途径中JAZ蛋白负调控下游bHLH（JAM1）转录因子活性[24]，揭示bHLH又受到植物抗逆激素信号途径上游调控因子的作用。外界环境能通过bHLH影响植物体内黄酮类物质的含量，其调控机制还需进一步研究。

本研究利用海南龙血树转录组数据，克隆了一个龙血树bHLH的基因DcbHLH1。DcbHLH1具有保守的HLH结构域，与其它植物的bHLH转录因子具有较高的同源性，表明该结构域在分子进化过程中具有较高的稳定性，这可能与其在不同植物的生理代谢中行使同一功能相关。DcbHLH1能够快速、显著地响应植物体内微环境的变化，DcbHLH1的组织特异性表达与龙血树中黄酮类化合物分布吻合，而DcbHLH1在处理后的表达明显降低。bHLH类转录因子在很多植物中都证明参与黄酮类化合物代谢的调控[25-27]，推测DcbHLH1可能作为1个负调控因子参与了龙血树中黄酮代谢途径。目前还未见到龙血树中血竭合成调控分子机制的报道，笔者下一步将对DcbHLH1基因的功能进行深入研究，为进一步阐明DcbHLH1蛋白在海南龙血树中血竭合成的调控机制奠定基础。

参考文献

[1] Pearson J， Prendergast H D V. Daemonorops， Dracaena and other dragon's blood[J]. Economic Botany， 2001， 55（4）： 474-477.

[2] 梅文莉， 戴好富， 吴 娇， 等. 海南龙血树抗肿瘤新用途研究[J]. 中药材， 2005， 28（10）： 871-873.

[3] Gupta D， Bleakley B， Gupta R K. Dragon's blood： Botany， chemistry and therapeutic uses[J]. Journal of Ethnopharmacology 2008， 115（3）： 361-380.

[4] Suchy V， Bobovnicky B， Trojánek J， et al. Homoisoflavans and other constituents of dragon's blood from Dracaena cinnabari[C]//Progress on Terrestrial and Marine Natural Products of Medicinal and Biological Interest American Botanical Council， Austin， 1991： 110-118.

[5] Masaoud M， Himmelreich U， Ripperger H， et al. New biflavonoids from dragon's blood of Dracaena cinnabari[J]. Planta Medica 1995， 61（4）： 341-344.

[6] Zheng Q A， Li H Z， Zhang Y J， et al. Dracaenogenins A and B， new spirostanols from the red resin of Dracaena cochinchinensis[J]. Steroids， 2006， 71（2）： 160-164.

[7] Zheng Q A， Xu M， Yang C R， et al. Flavonoid oligomers from Chinese dragon's blood， the red resins of Dracaena cochinchinensis[J]. Natural Products and Bioprospecting， 2012， 2（3）： 111-116.

[8] Chen H Q， Zuo W J， Wang H， et al. Two new antimicrobial flavanes from dragon's blood of Dracaena cambodiana[J]. Asian atural Product Reserch， 2012， 14（5）： 436-440.

[9] Wang X H， Zhang C， Yang L L. Gomes-Laranjo J. Production of dragon's blood in Dracaena cochinchinensis plants by inoculation of Fusarium proliferatum[J]. Plant Science， 2011， 180（2）： 292-299.

[10] Wang X H， Zhang C H， Wang Y， et al. Screen of micro-organisms for inducing the production of dragon's blood by leaf of Dracaena cochinchinensis[J]. Letters in Applied Microbiology， 2010， 51（5）： 504-510.

[11] Wang H， Luo G， Wang J， et al. Flavonoids produced by tissue culture of Dracaena cambodiana[J]. Natural Product Communications， 2014， 9（1）： 39-40.

[12] Wang H， Wang J Y， Sheng H Y， et al. HPLC-ESI-MS analysis of flavonoids produced by tissue culture of Dracaena cambodiana[J]. Chemical Research in Chinese Universities， 2014， 25（1）： 1-4.

[13] Martens S， Preuβ A， Matern U. Multifunctional flavonoid dioxygenases： Flavonol and anthocyanin biosynthesis in Arabidopsis thaliana[J]. Phytochemistry ， 2010， 71（10）： 1 040-1 049.

[14] 蔡文伟， 杨本鹏， 张树珍， 等. 龙血树总 RNA 提取方法的研究[J]. 中国热带医学， 2006， 6（2）： 242-243.

[15] 王佳媛， 戴好富， 李辉亮， 等. 海南龙血树查尔酮合酶基因 （DcCHS）的克隆及表达分析[J]. 热带作物学报， 2014， 35（8）： 1 539-1 545.

[16] Baudry A， Heim M A， Dubreucq B， et al. TT2， TT8， and TTG1 synergistically specify the expression of BANYULS and proanthocyanidin biosynthesis in Arabidopsis thaliana[J]. Plant Journal， 2004， 39（3）： 366-380.

[17] Carey C C， Strahle J T， Selinger D A， et al. Mutations in the pale aleurone color1 regulatory gene of the Zea mays anthocyanin pathway have distinct phenotypes relative to the functionally similar TRANSPARENT TESTA GLABRA1 gene in Arabidopsis thaliana[J]. Plant Cell， 2004， 16（2）： 450-464.

[18] Grove C A， De Masi F， Barrasa M I， et al. A multiparameter network reveals extensive divergence between C. elegans bHLH transcription factors[J]. Cell， 2009， 138： 314-327.

[19] Jiang Y Q， Yang B， Deyholos M K. Functional characterization of the Arabidopsis bHLH92 transcription factor in abiotic stress[J]. Molecular Genetic Genomics， 2009， 282： 503-516.

[20] Herrera Valderrama A L， Feller A， Martens S， et al. bHLH Transcription factors involved on the regulation of anthocyanin genes during fruit development in wild strawberry（Fragaria vesca）and red raspberry（Rubus ideaus）[C]//Postgraduate workshop of the DGB section. Pflanzliche Naturstoffe， 2014： 16.

[21] Schwinn K E， Boase M R， Bradley J M， et al. MYB and bHLH transcription factor transgenes increase anthocyanin pigmentation in petunia and lisianthus plants， and the petunia phenotypes are strongly enhanced under field conditions[J]. Frontiers Plant Science， 2014， 5（1）： 603.

[22] Steyn W J， Wand S J E， Jacobs G， et al. Evidence for a photoprotective function of low temperature induced anthocyanin accumulation in apple and pear peel[J]. Physiologia Plantarum， 2009， 136（4）： 461-472.

[23] Ubi B E， Honda C， Bessho H， et al. Expression analysis of anthocyanin biosynthetic genes in apple skin： effect of UV-B and temperature[J]. Plant Science， 2006， 170（3）： 571-578.

[24] Sasaki-Sekimoto Y， Saito H， Masuda S， et al. Comprehensive analysis of protein interactions between JAZ proteins and bHLH transcription factors that negatively regulate jasmonate signaling[J]. Plant Signaling Behavior， 2014， 9（1）： e27639.

[25] Appelhagen I， Jahns O， Bartelniewoehner L， et al. Leucoanthocyanidin Dioxygenase in Arabidopsis thaliana： Characterization of mutant alleles and regulation by MYB-BHLH-TTG1 transcription factor complexes[J]. Gene， 2011， 484（1）： 61-68.

[26] Matus J T， Poupin M J， Canón P， et al. Isolation of WDR and bHLH genes related to flavonoid synthesis in grapevine （Vitis vinifera L.）[J]. Plant Molecular Biology， 2010， 72 （6）： 607-620.

[27] Lillo C， Lea U S， Ruoff P. Nutrient depletion as a key factor for manipulating gene expression and product formation in different branches of the flavonoid pathway[J]. Plant Cell Environment， 2008， 31（5）： 587-601.